Khuếch đại dựa trên trình tự axit nucleic (NASBA)

Tổng quan

Trong sinh học phân tử và chẩn đoán y học, công tác phát hiện và định lượng các phân tử axit nucleic (ADN và ARN) có vai trò then chốt. Bởi vì lượng vật liệu di truyền trong mẫu ban đầu thường rất nhỏ, nhu cầu nhân bản các đoạn ADN hoặc ARN lên nhiều lần trở nên cần thiết nhằm tăng độ nhạy và độ chính xác của các xét nghiệm.

Phản ứng chuỗi Polymerase (PCR) là kĩ thuật khuếch đại ADN phổ biến đã cách mạng hóa nhiều lĩnh vực nghiên cứu. Tuy nhiên, PCR truyền thống chủ yếu dành cho ADN và đòi hỏi chu kì thay đổi nhiệt độ phức tạp. Khi cần phát hiện ARN, người ta thường phải dùng đến kĩ thuật RT-PCR (PCR phiên mã ngược), bao gồm bước chuyển đổi ARN thành ADN bổ sung (cDNA) trước khi tiến hành khuếch đại PCR. Do đó, quá trình thực hiện không những trở nên phức tạp hơn mà còn cần thiết bị luân nhiệt cồng kềnh và tốn kém. Hơn nữa, yêu cầu về chu trình nhiệt hạn chế khả năng ứng dụng PCR trong các thiết bị chẩn đoán nhanh, di động tại hiện trường.

Trước những hạn chế của PCR, kĩ thuật khuếch đại dựa trên trình tự axit nucleic (NASBA) đã được phát triển. NASBA là phương pháp phân tử tiên tiến được thiết kế chuyên biệt nhằm khuếch đại trực tiếp ARN trong điều kiện đẳng nhiệt (41°C), từ đó không cần sử dụng máy luân nhiệt. Đặc tính này biến NASBA thành công cụ linh hoạt, mạnh mẽ, phù hợp cho chẩn đoán nhanh, nghiên cứu biểu hiện gen và phát hiện mầm bệnh dựa trên ARN.

Các thành phần thiết yếu của phản ứng NASBA

Enzyme

Các enzyme trong NASBA là những protein xúc tác thực hiện các phản ứng hóa học cốt lõi của qui trình:

• AMV-RT (Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase) có vai trò vừa thực hiện phiên mã ngược nhằm tổng hợp cDNA từ ARN, vừa tổng hợp ADN nhằm tạo ADN mạch kép từ cDNA
• E. coli RNase H có chức năng phân hủy đặc hiệu sợi ARN trong phân tử lai RNA/DNA
• T7 ARN Polymerase tiến hành quá trình phiên mã, tạo ra nhiều bản sao ARN từ khuôn mẫu ADN chứa trình tự promoter T7

Mồi (Primers)

Các mồi trong NASBA là những đoạn oligonucleotide ngắn, sợi đơn với chức năng chuyên biệt:

• Mồi P1 được thiết kế để nhận diện và gắn vào ARN mục tiêu, đồng thời mang promoter T7—trình tự ADN được nhận diện bởi T7 ARN polymerase
• Mồi P2 có chức năng gắn vào sợi cDNA bổ sung được tạo ra trong quá trình phản ứng

Thành phần đệm

• Nucleoside triphosphates (NTPs và dNTPs) là những nguyên liệu cơ bản để tổng hợp các sợi ARN và ADN mới
• Dung dịch đệm thích hợp chứa các muối (như MgCl₂) và các yếu tố khác nhằm duy trì độ pH và tạo môi trường tối ưu cho hoạt động của các enzyme.

Quá trình phản ứng

Các bước chính trong qui trình NASBA bao gồm:

• Biến tính sơ bộ (pre denature): mặc dù NASBA được biết đến là phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt, qui trình này thực tế cần một bước biến tính sơ bộ trước khi bắt đầu chu trình khuếch đại chính. Trong bước này, hỗn hợp phản ứng được ủ tại nhiệt độ cao hơn trong khoảng 3–5 phút. Mục đích của bước biến tính sơ bộ là phá vỡ cấu trúc bậc hai của ARN mục tiêu (làm duỗi các vùng xoắn), loại bỏ các cấu trúc giúp ARN tự bảo vệ, từ đó làm tăng khả năng tiếp cận của mồi P1 đến trình tự đích và làm giảm sự lai không đặc hiệu của các mồi
• Gắn mồi P1: đoạn mồi P1 được thiết kế đặc biệt nhằm nhận diện và gắn vào trình tự ARN mục tiêu, nó chứa một trình tự khởi động (promoter) cho enzyme T7 ARN polymerase. Trình tự promoter này là tín hiệu để enzyme T7 ARN polymerase có thể bắt đầu quá trình phiên mã sau này.
• Phiên mã ngược (Reverse Transcription): enzyme phiên mã ngược từ virus Avian Myeloblastosis (AMV-RT – Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase) tổng hợp một sợi ADN bổ sung (cDNA) dựa trên khuôn mẫu là sợi ARN mục tiêu mà mồi P1 đã gắn vào. Kết quả thu được phân tử lai RNA/DNA.
• Phân hủy ARN: enzyme RNase H từ vi khuẩn Escherichia coli phân hủy sợi ARN trong phân tử lai RNA/DNA để tạo ra phân tử cDNA sợi đơn
• Gắn mồi P2: đoạn mồi P2 được thiết kế nhằm nhận diện và gắn vào vị trí tương ứng trên sợi cDNA đơn
• Hình thành ADN mạch kép: enzyme AMV-RT tiếp tục hoạt động, lần này sử dụng mồi P2 làm điểm khởi đầu nhằm tổng hợp sợi ADN thứ hai bổ sung với sợi cDNA ban đầu. Quá trình này tạo ra phân tử ADN mạch kép hoàn chỉnh. Phân tử ADN này mang thêm trình tự promoter T7 chức năng (do mồi P1 mang vào ban đầu).
• Khuếch đại ARN: enzyme T7 ARN polymerase nhận diện trình tự promoter T7 trên phân tử ADN mạch kép và tiến hành phiên mã, từ đó tạo ra rất nhiều bản sao ARN mới từ khuôn mẫu ADN. Các phân tử ARN mới được tạo ra này lại có thể quay lại chu trình từ bước 1 (gắn mồi P1), tạo thành một chu kì khuếch đại liên tục và tự duy trì, dẫn đến sự gia tăng số lượng ARN mục tiêu theo cấp số nhân.

Phương pháp phát hiện sản phẩm NASBA

Sau khi quá trình khuếch đại diễn ra, phát hiện các sản phẩm ARN được tạo ra là bước cuối cùng và cực kì quan trọng. Có một số phương pháp phổ biến được sử dụng để phát hiện sản phẩm NASBA bao gồm:

Molecular Beacons (Đầu dò phân tử dạng kẹp tóc)

Đây là một trong những phương pháp phổ biến nhất cho phát hiện sản phẩm khuếch đại theo thời gian thực (real-time). Molecular beacons là các đầu dò oligonucleotide sợi đơn có cấu trúc dạng kẹp tóc. Một đầu (thường là 5′) được gắn nhãn huỳnh quang (fluorophore) và đầu kia (thường là 3′) được gắn một chất dập tắt huỳnh quang (quencher). Khi trong trạng thái tự do, cấu trúc kẹp tóc giữ cho chất huỳnh quang và chất dập tắt gần nhau, từ đó làm tắt tín hiệu huỳnh quang. Tuy nhiên, khi có mặt ARN mục tiêu được khuếch đại, phần vòng của molecular beacon mở ra và gắn đặc hiệu vào trình tự ARN đó. Sự thay đổi cấu trúc này làm nhãn huỳnh quang và chất dập tắt tách xa nhau, từ đó cho phép phát ra tín hiệu huỳnh quang. Cường độ tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ thuận với lượng sản phẩm ARN được tạo ra và có thể được theo dõi liên tục trong suốt quá trình phản ứng.

Phát quang điện hóa (Electro-chemiluminescence – ECL)

Phương pháp này thường được khuyến nghị để phát hiện điểm cuối (end-point detection) sau khi phản ứng khuếch đại đã hoàn tất. Trong kĩ thuật này, các sản phẩm khuếch đại (amplicon) thường được lai với các đầu dò đặc hiệu đã được đánh dấu bằng một chất có khả năng phát quang khi có kích thích điện hóa. Tín hiệu phát quang được đo lường để xác định sự hiện diện hoặc định lượng sản phẩm NASBA.

Ưu điểm của NASBA

NASBA mang lại một số lợi thế đáng kể so với các kĩ thuật khuếch đại axit nucleic khác, đặc biệt là PCR:

• Điều kiện đẳng nhiệt: phản ứng hoạt động tại nhiệt độ không đổi (thường là 41°C) loại bỏ nhu cầu về máy luân nhiệt. Do đó, NASBA rất phù hợp để phát triển các thiết bị chẩn đoán di động, nhỏ gọn, có thể sử dụng tại hiện trường hoặc trong các cơ sở y tế có nguồn lực hạn chế.
• Khuếch đại đặc hiệu ARN: NASBA trực tiếp khuếch đại ARN mà không cần bước phiên mã ngược thành cDNA trước khi khuếch đại như trong RT-PCR nên qui trình trở nên đơn giản và nguy cơ sai sót liên quan đến bước phiên mã ngược được giảm thiểu.
• Khuếch đại nhanh chóng: phản ứng tự duy trì theo chu kĩ giúp đạt được mức độ khuếch đại đáng kể (lên đến hàng tỉ lần) chỉ trong một khoảng thời gian ngắn, thường từ 30 đến 90 phút.
• Độ nhạy và độ đặc hiệu cao: do sử dụng hai mồi đặc hiệu và có cơ chế khuếch đại dựa trên phiên mã, NASBA có tính đặc hiệu cao. Khi kết hợp với các phương pháp phát hiện thời gian thực như molecular beacons, NASBA có thể đạt độ nhạy rất cao, phát hiện được lượng ARN mục tiêu rất nhỏ và giảm thiểu nguy cơ kết quả dương tính giả.

Hạn chế của NASBA

Mặc dù có nhiều ưu điểm, NASBA cũng tồn tại một số hạn chế nhất định:

• Qui trình phản ứng tương đối phức tạp: phản ứng NASBA truyền thống thường yêu cầu một bước biến tính sơ bộ (pre-denaturation) trước khi bắt đầu ủ 41°C. Bước này nhằm mục đích làm duỗi thẳng cấu trúc phức tạp của ARN mục tiêu, từ đó giúp mồi dễ dàng tiếp cận và gắn vào. Tuy nhiên, điều này làm phức tạp hóa qui trình, từ đó gây nhiều khó khăn khi cần xử lí nhiều mẫu cùng lúc (high-throughput) hoặc khi triển khai tại thực địa.
• Enzyme nhạy cảm với nhiệt độ: enzyme T7 ARN polymerase khá nhạy cảm với sự biến động nhiệt độ và có thể mất hoạt tính nếu nhiệt độ không được kiểm soát chính xác nên cần thiết bị ủ nhiệt có độ chính xác cao.

Ứng dụng

Chẩn đoán lâm sàng

Trong lĩnh vực y tế, NASBA giữ vai trò trọng yếu trong chẩn đoán nhiều bệnh lí khác nhau. Kĩ thuật này được sử dụng rộng rãi nhằm phát hiện ARN và đánh giá tải lượng của các virus bao gồm HIV-1, virus viêm gan C và nhiều loại virus khác. NASBA cũng hiệu quả trong xác định các tác nhân gây bệnh là vi khuẩn như Mycobacterium tuberculosis (vi khuẩn gây bệnh lao), Chlamydia trachomatis và Neisseria gonorrhoeae. Với khả năng nhận dạng đặc hiệu loài của các tác nhân gây bệnh, NASBA cho phép cung cấp kết quả nhanh chóng và chính xác, giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị kịp thời.

Giám sát môi trường

Trong lĩnh vực bảo vệ môi trường và an toàn thực phẩm, NASBA đã trở thành công cụ quan trọng không thể thiếu. Kĩ thuật này được ứng dụng hiệu quả để phát hiện các mầm bệnh lây truyền qua đường nước như Cryptosporidium, Giardia và Norovirus, cũng như kiểm tra sự hiện diện của các vi sinh vật gây ô nhiễm trong thực phẩm hoặc nguồn nước. Nhờ độ nhạy cao và khả năng phát hiện nhanh chóng của NASBA, cơ quan quản lí có thể phát hiện sớm các mối nguy hiểm tiềm ẩn nhằm, từ đó có biện pháp can thiệp kịp thời nhằm bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Nghiên cứu

Trong nghiên cứu khoa học cơ bản, NASBA góp phần quan trọng trong mở rộng kiến thức về các quá trình sinh học tại cấp độ phân tử. Kĩ thuật này được sử dụng nhằm định lượng mức độ biểu hiện gen thông qua phân tích các phân tử ARN thông tin (mRNA) và nghiên cứu chức năng của các phân tử ARN không mã hóa. Khả năng khuếch đại đặc hiệu ARN mà không cần đến qui trình phức tạp của PCR làm cho NASBA trở thành công cụ lí tưởng cho các nghiên cứu về biểu hiện gen và điều hòa gen, từ đó mở ra nhiều hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực sinh học phân tử.

Tiến bộ kĩ thuật

Nghiên cứu khoa học đã đạt được những tiến bộ đáng kể trong cải thiện hiệu quả và đơn giản hóa qui trình của NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification):

• NASBA một bước (Single-Step NASBA): trong phương pháp này, người ta bổ sung các protein liên kết sợi đơn như protein gp32 từ thể thực khuẩn T4. Các protein này làm duỗi thẳng cấu trúc ARN và ngăn ngừa sự hình thành cấu trúc thứ cấp phức tạp trong quá trình thực hiện phản ứng. Nhờ vậy, toàn bộ phản ứng có thể diễn ra hoàn toàn trong một ống nghiệm và tại nhiệt độ duy nhất. Điều này giúp loại bỏ bước biến tính sơ bộ, từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho triển khai tại thực địa.
• Phát hiện siêu nhạy (Ultrasensitive Detection): độ nhạy của NASBA được cải thiện đáng kể thông qua tích hợp các hệ thống khuếch đại tín hiệu thứ cấp như NESBA (Nicking and Extension chain reaction System-Based Amplification). Hệ thống này khuếch đại các phân tử ADN chứa promoter T7 thông qua các chu kì cắt bằng enzyme đặc hiệu và kéo dài chuỗi lặp đi lặp lại để tạo ra nhiều bản sao hơn cho T7 ARN polymerase phiên mã.
• Đơn giản hóa quá trình phát hiện sản phẩm: người ta kết hợp NASBA với các phương pháp phát hiện tiên tiến như que thử sắc kí dòng chảy bên (lateral flow dipsticks) nhằm đáp ứng nhu cầu xét nghiệm nhanh chóng trong các ứng dụng lâm sàng và tại thực địa.

Lời kết

Với ưu điểm độc đáo là khả năng khuếch đại ARN trong điều kiện đẳng nhiệt, NASBA cho thấy tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, từ y học lâm sàng đến nghiên cứu môi trường và sinh học phân tử. Trong tương lai, với sự phát triển không ngừng của công nghệ sinh học phân tử và nhu cầu ngày càng cao về các phương pháp chẩn đoán nhanh, NASBA hứa hẹn tiếp tục được cải tiến và mở rộng, từ đó đóng góp quan trọng vào sự tiến bộ của y học và khoa học sinh học.