Công nghệ pyrosequencing

Công nghệ pyrosequencing là gì?

Giải trình tự ADN có vai trò nền tảng trong tiến trình phát triển sinh học phân tử, di truyền học và y sinh chẩn đoán. Năm 1977, phương pháp giải trình tự Sanger đã mở ra kỉ nguyên mới cho giải trình tự gen, đánh dấu bước ngoặt quan trọng trong lịch sử sinh học phân tử.

Tuy nhiên, phương pháp này dần bộc lộ nhiều hạn chế bao gồm:

• Chi phí cao do sử dụng nucleotide đánh dấu huỳnh quang
• Qui trình điện di phức tạp kéo dài thời gian xử lí
• Khả năng tự động hóa còn thấp nên không đáp ứng được nhu cầu giải trình tự bộ gen qui mô lớn

Do đó, công nghệ pyrosequencing trở thành giải pháp đột phá thay thế cho phương pháp Sanger. Pyrosequencing loại bỏ hoàn toàn nhu cầu sử dụng nucleotide đánh dấu và qui trình điện di, thay vào đó, nó áp dụng nguyên lí phát hiện trình tự ADN thông qua tín hiệu ánh sáng. Pyrosequencing nổi bật với khả năng đọc trình tự ngắn và phân tích dữ liệu theo thời gian thực. Từ đó, tốc độ xử lí mẫu tăng và chi phí giảm đáng kể. Mặc dù ngày nay có nhiều công nghệ giải trình tự ADN tiên tiến hơn, những nguyên lí cơ bản của pyrosequencing vẫn là nền tảng quan trọng phát triển các công nghệ giải trình tự thế hệ mới.

Lịch sử phát triển

Công nghệ giải trình tự pyrosequencing có nguồn gốc từ những nghiên cứu của nhà khoa học Pal Nyren vào năm 1987. Quá trình tổng hợp ADN có thể được phát hiện thông qua giải phóng một chất được gọi là pyrophosphate.

Năm 1990, Nyren cùng với các nhà khoa học khác là Mathias Uhlen và Bertil Pettersson phát triển phương pháp pyrosequencing dựa trên các hạt từ tính và chất phát quang của đom đóm nhằm phát hiện tín hiệu phát sáng trong quá trình giải trình tự ADN.

Sau đó, vào năm 1997, nhóm nghiên cứu này đã thành lập công ty Pyrosequencing AB nhằm thương mại hóa công nghệ này. Một năm sau, nhà khoa học khác là Mostafa Ronaghi cải tiến thêm qui trình bằng cách sử dụng một enzyme đặc biệt để phá hủy các nucleotide thừa.

Cuối cùng, năm 1999, công ty Pyrosequencing AB chính thức tung ra sản phẩm đầu tiên trên thị trường. Năm 2005, công nghệ này được công ty 454 Life Sciences mua lại và phát triển thành một nền tảng giải trình tự ADN qui mô lớn hơn được gọi là 454 Sequencing.

Công nghệ 454 Sequencing góp phần thúc đẩy quá trình phát triển của lĩnh vực giải trình tự ADN. Phương pháp này có thể tăng tốc độ và qui mô giải trình tự ADN lên nhiều lần so với phương pháp Sanger truyền thống. Từ đó, lĩnh vực sinh học phân tử và di truyền cũng phát triển vượt bậc. 454 Sequencing là tiền đề cho các công nghệ giải trình tự thế hệ mới như Illumina và Ion Torrent. Tuy nhiên, nhiều công nghệ giải trình tự tiên tiến hơn đã ra đời khiến nhu cầu sử dụng dụng 454 Sequencing giảm dần. Do đó, người ta đã ngừng sản xuất dòng máy này.

Nguyên lí hoạt động

Trước tiên, người ta chuẩn bị một đoạn ADN mạch đơn có gắn mồi tại vị trí cần giải trình tự. Các nucleotide tự do gồm A, T, G, C được bổ sung lần lượt vào hỗn hợp phản ứng, mỗi lần chỉ có một loại nucleotide nhất định được thêm vào. Nếu nucleotide thêm vào khớp với mạch khuôn ADN, enzyme ADN polymerase gắn nó vào mạch đang tổng hợp. Quá trình này giải phóng sản phẩm phụ là phân tử pyrophosphate.

Ngay sau đó, pyrophosphate được ATP sulfurylase chuyển hóa thành ATP. ATP vừa tạo ra lập tức trở thành nguồn năng lượng cho enzyme luciferase chuyển hóa cơ chất luciferin thành oxyluciferin—phân tử có khả năng phát quang. Phản ứng này tạo ra tín hiệu ánh sáng với cường độ tương ứng với số lượng nucleotide được gắn vào. Sau đó, hệ thống cảm biến hoặc camera ghi lại các tín hiệu ánh sáng. Mỗi đợt phát sáng tương ứng với một loại nucleotide cụ thể, thông qua đó người ta xác định được trình tự nucleotide của ADN.

Trước khi thêm một loại nucleotide mới, enzyme apyrase phân hủy toàn bộ nucleotide và ATP thừa nhằm làm sạch môi trường phản ứng. Các nucleotide được bổ sung tuần tự theo trình tự định sẵn để máy ghi nhận chính xác loại và số lượng nucleotide tại từng vị trí trên mạch ADN.

Qui trình thực hiện

Chuẩn bị mẫu

Mở đầu qui trình, ADN được tách chiết bằng phương pháp cơ học hoặc hóa học. Sau đó, người ta phân cắt ADN thành các đoạn nhỏ bằng enzyme cắt giới hạn hoặc phương pháp cơ học.

Khuếch đại bằng PCR

Khuếch đại vùng ADN cần giải trình tự bằng PCR nhằm tạo ra nhiều bản sao. Tiếp theo, sử dụng mồi gắn biotin để đánh dấu một sợi ADN. Sợi ADN này sẽ được tách ra bằng các hạt phủ streptavidin. Cuối cùng, gắn mồi vào đoạn ADN mạch đơn để thực hiện giải trình tự.

Phản ứng giải trình tự

Để tiến hành giải trình tự, người ta cần nạp mẫu ADN, các loại enzyme và chất nền vào thiết bị. Sau đó lần lượt thêm từng loại nucleotide vào môi trường phản ứng. Khi ATP cung cấp năng lượng cho enzyme luciferase chuyển luciferin thành oxyluciferin, phản ứng sẽ tạo ra tín hiệu ánh sáng để cảm biến ghi lại. Bổ sung enzyme apyrase nhằm phân hủy nucleotide thừa. Tiếp tục thêm loại nucleotide mới cho đến khi đủ 4 loại A, T, G và C.

Phân tích trình tự

Sau khi ghi lại các tín hiệu ánh sáng, thiết bị tiến hành phân tích trình tự nucleotide thông qua biểu đồ ánh sáng. Trong biểu đồ này, mỗi đỉnh sáng sẽ tương ứng với một nucleotide. Tiếp theo, người ta sử dụng công cụ tin sinh học để lắp ráp các đoạn ADN thành trình tự hoàn chỉnh.

Phân loại

Pyrosequencing pha rắn (Solid-phase pyrosequencing)

Pyrosequencing pha rắn ra đời vào cuối những năm 1990, là phương pháp pyrosequencing nguyên thủy, đặt nền móng cho quá trình phát triển của các công nghệ giải trình tự sau này, chủ yếu là các phương pháp giải trình tự thế hệ mới. Trong pyrosequencing pha rắn, các đoạn ADN được cố định trên một giá thể rắn, chẳng hạn như các hạt bead. Quá trình giải trình tự diễn ra trực tiếp trên mạch khuôn ADN đã được cố định này.

Pyrosequencing pha lỏng (Liquid-Phase pyrosequencing)

Khác với phương pháp pha rắn, pyrosequencing pha lỏng thực hiện giải trình tự trong dung dịch. Phương pháp này đơn giản hóa qui trình và giảm bớt một số khó khăn thường gặp của phương pháp pyrosequencing pha rắn. Tuy nhiên, nó ít được sử dụng trong các ứng dụng thông lượng cao. Các đoạn ADN mạch đơn được chuẩn bị và lai với mồi giải trình tự trong dung dịch. Các nucleotide được thêm vào tuần tự và mỗi lần nucleotide liên kết vào mạch bổ sung sẽ giải phóng pyrophosphate. Pyrophosphate sau đó được chuyển đổi thành ATP và phát hiện dưới dạng tín hiệu ánh sáng.

454 Pyrosequencing

Phương pháp 454 pyrosequencing có khả năng đọc trình tự ADN nhanh chóng bằng cách sao chép đồng thời nhiều đoạn ADN. ADN ban đầu được cắt thành nhiều đoạn nhỏ. Mỗi đoạn nhỏ này được gắn vào một hạt nhỏ. Các hạt này cùng với thành phần cần thiết cho phản ứng sao chép ADN được đưa vào từng giọt dầu nhỏ. Hàng triệu giọt dầu hoạt động như những ống nghiệm riêng biệt, cho phép sao chép hàng triệu đoạn ADN cùng lúc. Sau khi sao chép, mỗi hạt mang rất nhiều bản sao của cùng một đoạn ADN. Các hạt này sau đó được phân tích để xác định trình tự ADN dựa trên ánh sáng phát ra khi các thành phần của ADN được thêm vào.

Giải trình tự pyrosequencing vi lưu (microfluidic pyrosequencing)

Tương tự với 454 pyrosequencing, phương pháp giải trình tự pyrosequencing vi lưu cũng sao chép và đọc trình tự ADN nhưng sử dụng công nghệ tiên tiến hơn. Thay vì sử dụng các giọt dầu, các đoạn ADN được gắn vào hạt và được đưa vào hệ thống kênh dẫn siêu nhỏ trên một con chip. Hệ thống này cho phép tự động hóa quá trình sao chép và đọc trình tự. Do đó, phương pháp trở nên hiệu quả, tiết kiệm hóa chất và thời gian hơn.

Ưu, nhược điểm

Ưu điểm

Kĩ thuật pyrosequencing gồm các ưu điểm sau:

• Cung cấp dữ liệu giải trình tự ngay trong quá trình thực hiện giúp theo dõi và kiểm soát quá trình một cách liên tục
• Xử lí nhiều mẫu đồng thời nên rất hữu ích với các dự án giải trình tự bộ gen qui mô lớn
• Kết quả được chuyển đổi trực tiếp thành biểu đồ, không cần bước điện di phân tích sau giải trình tự nên tiết kiệm thời gian và chi phí
• Yêu cầu ít bước chuẩn bị và tiền xử lí mẫu hơn một số phương pháp khác
• Sử dụng nucleotide không qua biến đổi giúp giảm chi phí và đơn giản hóa qui trình

Nhược điểm

Bên cạnh các ưu điểm vượt trội, pyrosequencing vẫn còn một số hạn chế bao gồm:

• Tạo ra các đoạn đọc tương đối ngắn
• Xảy ra lỗi khi giải các trình tự chứa nhiều nucleotide lặp lại
• Chi phí của mỗi cặp base cao hơn so với các phương pháp thông lượng cao khác

Ứng dụng

Một trong những ứng dụng quan trọng của phương pháp pyrosequencing là xác định và nghiên cứu các biến dị di truyền bao gồm các đa hình đơn nucleotide và các loại đột biến khác. Thông tin này rất hữu ích để lập bản đồ di truyền, giúp các nhà nghiên cứu hiểu rõ hơn về đột biến liên quan đến bệnh, sàng lọc di truyền và y học cá thể hóa. Cụ thể hơn, pyrosequencing cho phép xác định và định lượng chính xác đa hình đơn nucleotide cũng như phát hiện và mô tả các đột biến chèn-xóa.

Ngoài ra, pyrosequencing cũng được sử dụng trong nghiên cứu các mẫu methyl hóa ADN giúp hiểu rõ hơn về điều hòa gen và các thay đổi biểu sinh liên quan đến bệnh tật. Kĩ thuật này định lượng mức độ methyl hóa tại các vị trí CpG cụ thể, cung cấp thông tin chi tiết về điều hòa biểu hiện gen và các biến đổi biểu sinh.

Trong nghiên cứu ung thư, pyrosequencing được sử dụng nhằm xác định các đột biến đặc trưng của khối u, hỗ trợ phát hiện các dấu ấn sinh học và phát triển các liệu pháp nhắm mục tiêu. Khả năng phát hiện các đột biến soma trong ADN khối u giúp chẩn đoán, tiên lượng và lập kế hoạch điều trị ung thư.

Người ta cũng ứng dụng pyrosequencing trong nghiên cứu vi sinh vật, chủ yếu nhằm xác định vi khuẩn. Bằng cách giải trình tự các vùng bảo tồn như gen 16S rRNA, pyrosequencing có thể phân biệt các loài vi khuẩn khác nhau, từ đó hỗ trợ xác định vi sinh vật, nghiên cứu metagenomics và microbiome. Hơn nữa, khả năng xác định các mầm bệnh khác nhau của pyrosequencing làm cho phương pháp này trở nên hữu ích trong chẩn đoán lâm sàng và nghiên cứu dịch tễ học.

Lời kết

Pyrosequencing là một công cụ đắc lực trong lĩnh vực giải trình tự ADN. Với khả năng giải trình tự thời gian thực và độ chính xác cao, phương pháp này được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh học phân tử, di truyền và y sinh. Tuy có hạn chế về độ dài đoạn đọc so với các công nghệ giải trình tự thế hệ mới khác nhưng những ưu điểm về tốc độ, tính linh hoạt và chi phí hợp lí khiến pyrosequencing vẫn là lựa chọn hấp dẫn. Pyrosequencing hứa hẹn sẽ tiếp tục giữ vai trò quan trọng trong các ứng dụng nghiên cứu sinh học phân tử và y sinh.