RT-qPCR — Kỹ thuật PCR định lượng mARN theo thời gian thực

Kỹ thuật PCR định lượng mARN (reverse transcription–quantitative polymerase chain reaction hay RT-qPCR) có nguồn gốc từ công nghệ PCR—phương pháp sinh học phân tử tạo ra hàng triệu hoặc hàng tỉ bản sao trình tự ADN. Người ta ứng dụng PCR trong nhiều lĩnh vực như cấy ghép, pháp y, chẩn đoán di truyền cũng như phát hiện bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn và virus. Từ năm 1993, nhiều phiên bản cải tiến của PCR dần xuất hiện. Trong đó, phương pháp kết hợp phản ứng phiên mã ngược mARN thành ADN (reverse transcription) với PCR định lượng theo thời gian thực (real-time PCR hay quantitative PCR) đã trở thành một trong những kỹ thuật chẩn đoán tiêu chuẩn.

Nguyên lý

Gen cung cấp hướng dẫn tạo ra protein hoặc ARN không mang thông tin di truyền nhằm thực hiện các chức năng của cơ thể thông qua quá trình biểu hiện gen. Quá trình này bao gồm hai bước chính: trình tự ADN phiên mã thành ARN mang thông tin di truyền (mARN), sau đó mARN dịch mã thành protein.

Phần lớn tế bào trong cơ thể có cùng bộ gen nhưng các gen trong mỗi loại tế bào hoạt động khác nhau. Ngoài ra, số lượng bản sao gen giữa người bình thường và người mắc bệnh có thể bằng nhau nhưng chúng có mức độ biểu hiện khác biệt. Vì vậy, trong một số trường hợp, phương pháp phân tích ADN không phản ánh đúng nguyên nhân hay nguy cơ mắc bệnh. Thay vào đó, thông tin về phân tử mARN như vị trí, thời điểm xuất hiện cũng như số lượng có thể chẩn đoán chính xác hơn về những thay đổi trong cơ thể. Do kỹ thuật này có nguồn gốc từ PCR—phản ứng khuếch đại phân tử ADN—nên người ta cần bổ sung phản ứng phiên mã ngược với enzyme reverse transcriptase nhằm chuyển trình tự mARN thành ADN hay còn gọi là cADN (complementary ADN) trước khi thực hiện PCR.

Ngoài ra, kỹ thuật PCR theo thời gian thực thể hiện mức độ biểu hiện của gen (định lượng) trong khi phương pháp PCR truyền thống chỉ cho biết gen có xuất hiện hay không (định tính) và ước tính số lượng bản sao gen (bán định lượng). Đối với phương pháp PCR, người ta xác định số lượng bản sao gen vào cuối phản ứng. Tuy nhiên, khi phản ứng gần kết thúc, các thành phần hoá chất dần hết, đồng thời lượng pyrophosphate—sản phẩm phụ của quá trình nhân đôi ADN—tăng cao dẫn đến ức chế ADN polymerase (enzyme tham gia tạo bản sao gen). Vì vậy, kỹ thuật này không đảm bảo phản ánh đúng số lượng bản sao gen trong mẫu ban đầu. Trong khi đó, phản ứng realtime PCR cung cấp kết quả định lượng dựa vào giá trị Ct (threshold cycle)—chu kỳ hay thời điểm tín hiệu của mẫu vượt ngưỡng tín hiệu nền. Nếu mẫu ban đầu chứa nhiều gen mục tiêu, số lượng bản sao sẽ tăng nhanh, dẫn đến tín hiệu sớm vượt ngưỡng và do đó mẫu có giá trị Ct thấp. Người ta so sánh Ct của mẫu xét nghiệm với mẫu chuẩn có nồng độ hoặc lượng bản sao đã xác định trước đó.

Phân loại

Phản ứng RT-qPCR có thể diễn ra theo quy trình một bước hoặc hai bước. Đối với quy trình một bước, người ta chuẩn bị hoá chất, enzyme reverse transcriptase và ADN polymerase trong cùng một ống nghiệm nhằm kết hợp giai đoạn phiên mã ngược với PCR. Trong trường hợp hai bước, sau khi ARN phiên mã ngược thành cADN trong ống nghiệm chứa reverse transcriptase, người ta chuyển mẫu sang ống nghiệm mới với các hoá chất, enzyme cũng như những điều kiện khác phù hợp cho phản ứng realtime PCR.

	Realtime RT-qPCR một bước	Realtime RT-qPCR hai bước
Ưu điểm	Hạn chế thay đổi điều kiện phản ứng Giảm nguy cơ nhiễm mẫu Phù hợp với các ứng dụng quy mô lớn Tiết kiệm thời gian, dễ lặp lại thí nghiệm	Có thể dự trữ cADN trong thời gian dài nhằm thực hiện nhiều phản ứng khác nhau Khuếch đại gen mục tiêu và gen tham chiếu từ cùng một mẫu cADN Dễ dàng tối ưu hoá chất và điều kiện thí nghiệm cho mỗi giai đoạn Có thể lựa chọn nhiều loại mồi hơn
Nhược điểm	Không thể tối ưu từng phản ứng Giảm độ nhạy	Tăng nguy cơ nhiễm mẫu Tốn nhiều thời gian hơn Cần nhiều bước tối ưu hoá hơn

Thành phần của phản ứng

Một số thành phần quan trọng trong kỹ thuật RT-qPCR bao gồm:

Giai đoạn phiên mã ngược

• Mẫu ARN: chứa trình tự cần phiên mã ngược thành cADN
• Enzyme reverse transcriptase: tham gia chuyển trình tự ARN thành ADN
• Mồi: oligo(dT) bám vào mARN của sinh vật nhân thực, mồi ngẫu nhiên bám vào các loại ARN khác, mồi đặc hiệu cho gen mục tiêu (dùng trong quy trình một bước)
• dNTPs (A, T, G, C): nguyên liệu cấu tạo nên ADN
• DTT: chất khử giúp tăng hoạt tính enzyme
• Chất ức chế RNase: ngăn chặn quá trình phân giải ARN
• Nước không chứa nuclease: loại bỏ các yếu tố phân giải ARN
• Dung dịch đệm: tạo môi trường tối ưu cho enzyme hoạt động hiệu quả

Giai đoạn realtime PCR

• Mẫu cADN: chứa trình tự mục tiêu cần khuếch đại
• Mồi: bám vào hai đầu trình tự mục tiêu nhằm đánh dấu vị trí cần nhân bản.
• Enzyme ADN polymerase: tổng hợp mạch ADN mới
• dNTPs (A, T, G, C): nguyên liệu cấu tạo nên ADN
• Dung dịch đệm: tạo môi trường tối ưu cho enzyme hoạt động hiệu quả
• Muối magie clorua: kích hoạt enzyme ADN polymerase
• Chất phát huỳnh quang: phản ánh số lượng bản sao ADN trong mẫu

Các dạng tín hiệu huỳnh quang

Người ta phân loại các chất phát huỳnh quang trong phản ứng realtime PCR thành hai nhóm chính.

Nhóm I

Nhóm I bao gồm những chất chèn vào giữa cấu trúc mạch đôi của ADN như SYBR Green I và EvaGreen, do đó phát hiện cả bản sao của gen mục tiêu và không phải mục tiêu.

Nhóm II

Trong khi đó, các chất thuộc nhóm II gắn với đoạn dò có thể liên kết đặc hiệu với trình tự ADN mục tiêu. Người ta thường dùng đoạn dò Taqman kết hợp với chất phát huỳnh quang (reporter) và chất hấp thụ huỳnh quang (quencher). Trước phản ứng, reporter và quencher nằm gần nhau trên đoạn dò Taqman nên quencher trực tiếp hấp thụ tín hiệu từ reporter, do đó không có tín hiệu huỳnh quang phát ra. Tuy nhiên, nếu trình tự mục tiêu hiện diện, đoạn dò sẽ bám vào nó. Khi phản ứng xảy ra, enzyme Taq polymerase cắt bỏ đoạn dò trong khi tổng hợp mạch ADN mới, dẫn đến reporter và quencher tách ra. Vì vậy, tín hiệu kích thích từ reporter phát ra dưới dạng huỳnh quang và được máy tính ghi nhận. Sau mỗi chu kỳ, nhiều đoạn dò bị cắt ra làm tăng cường độ huỳnh quang của mẫu.

Quy trình thực hiện

Giai đoạn 1: Chuẩn bị mẫu

Bước 1: Thu nhận ARN

Hiện nay có nhiều phương pháp tách chiết ARN từ các mẫu bệnh phẩm khác nhau. Nhìn chung, các phương pháp này cần đảm bảo độ tinh sạch và tính nguyên vẹn của ARN—mẫu ARN sau khi thu nhận không lẫn các thành phần khác và không đứt gãy. Trong quá trình tách chiết, xử lý, bảo quản, phân tích, kỹ thuật viên cần kiểm soát dụng cụ và hoá chất thí nghiệm nhằm giảm nguy cơ nhiễm chất ức chế reverse transcriptase hoặc chất phân giải ARN. Điều kiện bảo quản thích hợp cho ARN là –80°C, đồng thời hạn chế làm đông và rã đông liên tục.

Bước 2: Đánh giá ARN

Chất lượng và số lượng mẫu ARN cần được đánh giá trước khi đưa vào những phân tích tiếp theo. Người ta thường sử dụng máy quang phổ UV với bước sóng 260 nm trong định lượng ARN (giá trị A260). Muối, nucleotide tự do, dung môi, chất tẩy, protein,… có thể còn sót lại sau quá trình tách chiết ARN. Vì vậy, kỹ thuật viên cần đo lường giá trị tại những bước sóng khác nhằm đánh giá độ tinh sạch của ARN, từ đó xác nhận kết quả định lượng.

Những thông số và tỉ lệ cần đạt được nhằm xác nhận kết quả định lượng ARN bao gồm:

Bước sóng	Thành phần hấp thụ (hiện diện trong mẫu)	Tỉ lệ tiêu chuẩn
230 nm	Hợp chất hữu cơ, đường, urea, muối	A260/A230 > 1,8
260 nm	Nucleic acid toàn phần	A260 ≈ 0.1–1,0
270 nm	Phenol	A260/A270 > 1,0
280 nm	Protein	A260/A280 ≈ 2,0
330 nm	Ánh sáng bị tán xạ	A330 = 0

Tuy nhiên, các phân tử nucleic acid khác như ADN cũng hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 260 nm. Một số phương pháp khác xác định hàm lượng ARN chính xác hơn bằng cách sử dụng chất nhuộm phát huỳnh quang đặc hiệu cho ARN nhằm loại bỏ tín hiệu gây nhiễu từ ADN. Ngoài ra, độ nguyên vẹn của ARN được đánh giá thông qua tỉ lệ của rARN 28S và 18S (hai dạng ARN hiện diện nhiều nhất) bằng phương pháp điện di trên gel. Mẫu ARN đạt chuẩn có giá trị 28S:18S bằng 2:1.

Bước 3: Loại bỏ ADN

Mẫu ARN chứa nhiều ADN có thể ảnh hưởng đến tín hiệu nền khi thực hiện realtime PCR và dẫn đến kết quả dương tính giả. Vì vậy, người ta cần sử dụng enzyme phân giải ADN nhằm loại bỏ yếu tố này. Tuy nhiên, nếu enzyme này không được loại bỏ cẩn thận khỏi mẫu, nó có thể phân giải mồi, ARN và các đoạn cADN.

Hiện nay người ta đã phát triển enzyme ezDNase có khả năng loại bỏ ADN mạch đôi thuộc bộ gen mà không tác động đến ARN hoặc các đoạn ADN mạch đơn hình thành trong quá trình phản ứng. Người ta ủ mẫu với ezDNase trong 2 phút tại 37°C, sau đó bất hoạt enzyme bằng cách tăng nhiệt độ lên 55°C.

Giai đoạn 2: Phiên mã ngược

Bước 1: Biến tính và gắn mồi

Người ta sử dụng nhiệt độ cao nhằm thay đổi cấu trúc ARN, nhờ đó các đoạn mồi có thể gắn lên phân tử này. Ống nghiệm chứa ARN, các loại mồi và dNTPs được ủ tại nhiệt độ 65°C trong 5 phút. Sau đó, người ta hạ nhiệt của mẫu trong 1 phút bằng cách đặt trên đá lạnh. Đối với mồi hexamer ngẫu nhiên, kỹ thuật viên có thể ủ mẫu tại nhiệt độ phòng thêm 10 phút sau khi bổ sung enzyme trong bước tiếp theo.

Bước 2: Tổng hợp cADN

Sau khi mồi gắn vào mạch khung ARN, reverse transcriptase sẽ bổ sung các nucleotide nhằm tạo nên mạch cADN. Nhiệt độ và thời gian thực hiện bước này phụ thuộc vào loại enzyme được sử dụng, thường trong khoảng 37–55°C. Đối với enzyme có khả năng chịu nhiệt tốt, người ta có thể đặt nhiệt độ cao hơn nhằm tăng hiệu quả phản ứng.

Bước 3: Bất hoạt enzyme

Dừng phản ứng bằng cách bất hoạt reverse transcriptase tại nhiệt độ 70–85°C trong 5–15 phút.

Giai đoạn 3: PCR định lượng theo thời gian thực

Bước 1: Biến tính cADN

Hỗn hợp phản ứng được gia nhiệt lên 95°C. Nhiệt độ cao phá vỡ liên kết giữa các base trong 2 mạch cADN khuôn, dẫn đến phân tử ADN tách ra thành 2 mạch đơn. Các ADN đơn là khuôn mẫu tạo ra bản sao mới. Bước này cần được duy trì nhiệt độ đủ lâu nhằm đảm bảo các sợi ADN tách hoàn toàn.

Bước 2: Gắn mồi và đoạn dò huỳnh quang

Máy hạ nhiệt độ xuống 55–65°C nhằm tạo điều kiện cho các mồi gắn vào vị trí cụ thể trên mạch ADN đơn. Các mồi bám vào ADN tạo nên vùng ADN kép ngắn làm điểm khởi đầu cho quá trình tổng hợp ADN. Đối với đoạn dò Taqman, đoạn dò cũng bám lên mạch ADN đơn vào thời điểm này.

Bước 3: Kéo dài mạch

Máy luân nhiệt tăng nhiệt độ lên 72°C tạo điều kiện cho enzyme polymerase tổng hợp mạch ADN mới dựa theo trình tự mạch khuôn. Khi đó, đoạn dò Taqman tách ra khỏi mạch ADN ban đầu, dẫn đến quencher cách xa reporter nên giải phóng tín hiệu huỳnh quang. Trong trường hợp phản ứng sử dụng SYBR Green hoặc các chất phát huỳnh quang tương tự, những chất này gắn vào cấu trúc mạch đôi của các đoạn ADN mới hình thành và phát tín hiệu.

Ứng dụng

Định lượng mức độ biểu hiện gen

RT-qPCR là một trong những phương pháp tiêu chuẩn giúp đo lường mức độ biểu hiện gen từ nhiều loại mẫu khác nhau như mô, máu hoặc tế bào nuôi cấy từ vi khuẩn, thực vật, động vật, người.

Người ta thường ứng dụng kỹ thuật này nhằm các mục đích sau:

• Nghiên cứu biểu hiện gen trong các mô tại mỗi giai đoạn phát triển.
• So sánh thay đổi về biểu hiện gen giữa mẫu bình thường và mẫu bệnh lý.
• Đánh giá ảnh hưởng của thuốc hoặc phương pháp trị liệu đối với biểu hiện gen.

Nghiên cứu các chất can thiệp ARN

Một số dạng ARN như siARN (small-interfering RNA) hay miARN (micro RNA) có thể can thiệp vào quá trình biểu hiện gen bằng cách ức chế hoặc kích hoạt giai đoạn phiên mã và dịch mã. Người ta sử dụng kỹ thuật RT-qPCR nhằm tìm ra và xác nhận cách hoạt động của những chất này. Đây là tiền đề cho các nghiên cứu chuyên sâu hơn về cơ chế gây bệnh.

Chẩn đoán bệnh truyền nhiễm do virus

Một số loại virus có vật liệu di truyền thuộc dạng ARN thay vì ADN. Vì vậy, người ta cần sử dụng RT-qPCR nhằm chuyển ARN của chúng thành trình tự ADN để định lượng. Ngoài ra, RT-qPCR có độ nhạy cao nên có thể phát hiện virus khi chỉ có vài bản sao ARN hiện diện trong mẫu bệnh phẩm, nhờ đó bác sĩ chẩn đoán bệnh sớm và đề xuất phương pháp can thiệp kịp thời.

Xét nghiệm sinh vật, thực phẩm biến đổi gen

Sinh vật biến đổi gen được tạo ra bằng cách đưa những gen mới vào cơ thể của sinh vật bình thường. Những đoạn gen này thường chứa một số trình tự đặc trưng có thể được phát hiện thông qua phản ứng RT-qPCR. Người ta cần xác nhận các sinh vật hay thực phẩm biến đổi gen nhằm đảm bảo tuân thủ các quy định về nhãn hiệu cũng như truy xuất nguồn gốc thực phẩm.

Ưu điểm và nhược điểm

Ưu điểm

• Độ nhạy cao: có thể phát hiện ARN với nồng độ rất thấp
• Độ đặc hiệu cao: mồi và đoạn dò liên kết đặc hiệu với vùng gen mục tiêu
• Nhanh chóng: tiết kiệm thời gian so với các phương pháp nuôi cấy truyền thống
• Định lượng chính xác: kết quả phản ánh lượng ARN mục tiêu trong mẫu với độ chính xác cao.

Nhược điểm

• Chi phí cao: thiết bị, hoá chất, chất phát huỳnh quang,… thường có giá thành cao nên không phù hợp với một số điều kiện phòng thí nghiệm.
• Khó bảo quản ARN: mẫu ARN dễ bị phân hủy trong quá trình tách chiết và bảo quản nếu nhiễm enzyme phân giải ARN.
• Nguy cơ dương tính giả: có thể xảy ra hiện tượng dương tính giả nếu không đảm bảo độ tinh sạch của mẫu và độ đặc hiệu của mồi hay đoạn dò.

Lời kết

RT-qPCR là một trong những kỹ thuật sinh học phân tử phổ biến nhất hiện nay. Kỹ thuật này tạo ra các bản sao của trình tự ADN mục tiêu sau khi phiên mã ngược từ ARN. Kết quả được ghi nhận dưới dạng tín hiệu huỳnh quang vào thời điểm tín hiệu vượt ngưỡng tín hiệu nền. Với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, RT-qPCR được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu biểu hiện gen, đánh giá hiệu quả điều trị, phát hiện virus có vật liệu di truyền ARN cũng như kiểm định sinh vật biến đổi gen. Hiện nay người ta đang tiếp tục cải tiến và phát triển công nghệ này nhằm khắc phục các nhược điểm, tăng hiệu quả phản ứng, cải thiện độ chính xác cũng như giảm giá thành.