Công nghệ phản ứng chuỗi ligase

Hiện nay, người ta đã phát triển nhiều kỹ thuật xét nghiệm di truyền nhằm tìm ra các đột biến gen gây bệnh. Tuy nhiên, những phương pháp này có một số hạn chế về độ nhạy, đặc hiệu, chi phí và thời gian. Từ cuối thế kỉ XX, công nghệ phản ứng chuỗi ligase (Ligase Chain Reaction – LCR) đã xuất hiện và trở thành một trong những kĩ thuật được ứng dụng rộng rãi trong phát hiện đột biến gen cũng như xác định kiểu gen của những chất có nồng độ thấp trong mẫu xét nghiệm.

Nguyên lí

Phản ứng chuỗi ligase tạo ra một lượng lớn bản sao của các đoạn ADN dựa trên nguyên tắc của phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Tuy nhiên, trong khi PCR sử dụng một cặp mồi với enzyme ADN polymerase, kĩ thuật này cần hai cặp mồi với mỗi cặp bám vào hai đoạn trình tự liên tiếp trên cùng một mạch ADN. Sau đó, enzyme ligase bổ sung liên kết phosphodiester nhằm nối hai đoạn mồi trên cùng mạch đơn với nhau. Mạch mới hình thành sẽ tiếp tục tham gia vào các chu kỳ tiếp theo của phản ứng. Nếu đoạn trình tự mục tiêu chứa nucleotide đột biến, mồi không thể bám vào mạch khuôn, dẫn đến phản ứng ngừng lại và đoạn gen không được nhân bản.

Các đoạn mồi được đánh dấu bằng nhiều phương pháp khác nhau nhằm ghi nhận sự hiện diện của bản sao các trình tự mục tiêu sau phản ứng.

Một số kĩ thuật phân tích kết quả bao gồm:

• Đánh dấu đồng vị phóng xạ
• Gắn chất phát huỳnh quang
• Thử nghiệm miễn dịch phát huỳnh quang
• Thử nghiệm miễn dịch phát quang
• Cảm biến sinh học
• Hoá phát quang
• Chuyển đổi năng lượng cộng hưởng huỳnh quang
• Điện hoá phát quang
• Điện hoá
• Chấm lượng tử đơn
• Tán xạ Raman tăng cường bề mặt

Phân loại

Người ta đã phát triển nhiều phiên bản cải tiến của phản ứng chuỗi ligase nhằm phục vụ cho các mục đích khác nhau.

Một số kỹ thuật cơ bản bao gồm:

Phản ứng phát hiện ligase (Ligase Detection Reaction – LDR)

Phản ứng này chỉ sử dụng hai mồi liên kết với trình tự mục tiêu trên một mạch đơn. Người ta thường ứng dụng nó nhằm phát hiện các thay đổi về một nucleotide từ sản phẩm nhân bản của phản ứng khác như PCR.

Phản ứng chuỗi ligase lồng hai cặp mồi (Nested LCR)

Kỹ thuật này cần sử dụng hai ống nghiệm, mỗi ống chứa hai cặp mồi với chiều dài của một mồi xấp xỉ 15 nucleotide. Trong ống nghiệm 1, mỗi cặp mồi với bám vào một bên (trái hoặc phải) của trình tự mục tiêu trên một mạch. Hai cặp mồi trong ống nghiệm 2 bám vào phần trình tự còn lại của mỗi mạch. Mỗi cặp mồi liên tiếp trong từng ống nghiệm nối với nhau thành đoạn trình tự có độ dài 30 nucleotide. Sau đó, người ta trộn hỗn hợp từ hai ống nghiệm và tiếp tục phản ứng nhằm nối đoạn mồi bên trái và phải của trình tự mục tiêu với nhau, tạo thành sản phẩm cuối cùng với độ dài khoảng 60 nucleotide.

Phản ứng chuỗi ligase chứa khoảng trống (Gap-LCR – GLCR)

Trong phản ứng này, người ta thiết kế cặp mồi trên cùng một mạch cách nhau vài nucleotide. Khi đó, enzyme ADN polymerase bổ sung các nucleotide còn thiếu vào khoảng trống này và ADN ligase nối hai đoạn trình tự với nhau. Ngoài ra, người ta còn kết hợp kỹ thuật này với phương pháp định lượng ADN theo thời gian thực. Trong một cặp mồi, mỗi mồi lần lượt gắn với chất phát và hấp thụ tín hiệu huỳnh quang. Khi chất phát tín hiệu được kích thích, nó truyền tín hiệu huỳnh quang cho chất nhận. Người ta ghi nhận tín hiệu này bằng máy tính nhằm xác định lượng ADN trong mẫu ban đầu.

Thành phần của phản ứng

Các thành phần cơ bản của một phản ứng chuỗi ligase bao gồm:

• Mẫu ADN: chứa trình tự mục tiêu cần khuếch đại
• Mồi (primer): các đoạn ADN ngắn được tổng hợp nhân tạo, chúng có nhiệm vụ bám vào hai đầu trình tự mục tiêu nhằm đánh dấu vị trí cần nhân bản. Các mồi này thường được tổng hợp bằng phương pháp hóa học
• Enzyme ADN ligase: liên kết hai đoạn mồi liền kề tạo thành sản phẩm nhân bản hoàn chỉnh
• Dung dịch đệm: tạo môi trường tối ưu cho enzyme hoạt động hiệu quả

Qui trình thực hiện

Bước 1: Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng

Chuẩn bị dung dịch đệm cùng các loại mồi trong ống nghiệm và trộn đều.

Bước 2: Biến tính ADN

Gia nhiệt phản ứng lên 100°C trong 2 phút. Nhiệt độ cao phá vỡ liên kết giữa các base trong 2 mạch ADN khuôn, dẫn đến phân tử ADN tách ra thành 2 mạch đơn. Các ADN đơn là khuôn mẫu tạo ra bản sao mới. Làm lạnh ống nghiệm đến nhiệt độ phòng, sau đó ly tâm để thu mẫu tại đáy ống nghiệm và đặt trên đá lạnh trong vài phút.

Bước 3: Bổ sung enzyme

Bổ sung dung dịch chứa enzyme ligase vào ống nghiệm. Lần lượt thay đổi nhiệt độ phản ứng giữa 90°C và 55°C với số chu kỳ cần thiết.

Bước 4: Kết thúc phản ứng

Ly tâm mẫu tại nhiệt độ phòng và bổ sung dung dịch đệm bất hoạt phản ứng.

Bước 5: Phân tích kết quả

Sử dụng kỹ thuật điện di kết hợp máy chụp phóng xạ, máy chụp ảnh huỳnh quang hoặc các thiết bị và phương pháp phân tích kết quả khác.

Ứng dụng

Phát hiện vi sinh vật, virus gây bệnh

Phản ứng chuỗi ligase được ứng dụng trong các xét nghiệm nhằm phát hiện vi sinh vật và virus như:

• Vi khuẩn gây bệnh lậu (Neisseria gonorrhoeae)
• Vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)
• Vi khuẩn lây nhiễm qua đường tình dục (Chlamydia trachomatis)
• Vi khuẩn trong máu (Bacillus anthracis, Streptococcus pyogenes, Bacillus cereus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli,…)
• Vi khuẩn trong thực phẩm (Bacillus cereus, Campylobacter coli, Shigella spp., Cronobacter sakazakii, Vibrio vulnificus,…)
• Virus (virus hợp bào hô hấp, virus đậu mùa, HIV, SARS,…)

Xác định đột biến gây bệnh

Người ta sử dụng kỹ thuật này nhằm xác định các đột biến liên quan đến nhiều bệnh như:

• Đột biến gây bệnh hồng cầu hình liềm
• Đột biến A3243G liên quan đến bệnh não cơ ti thể, nhiễm toan lactic và đột quỵ
• Đột biến gen ức chế khối u TP53
• Đột biến gen sinh ung thư K-ras
• Đột biến gen MIR196A2 trong viêm gan B và ung thư gan
• Đột biến gen BRCA1 gây ung thư vú

Ưu điểm và nhược điểm

Ưu điểm

Phản ứng chuỗi ligase phù hợp với những mẫu xét nghiệm có lượng ADN thấp. Kĩ thuật này có độ đặc hiệu (100%) cao hơn và độ nhạy (97,6%) gần bằng phương pháp PCR truyền thống (lần lượt là 90% và 99,5%). Ngoài ra, phương pháp có chi phí tương đối thấp cũng như có thể kết hợp với nhiều phương pháp phát hiện khác nhau như điện di, huỳnh quang. Nhờ đó, công nghệ này được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh, phát hiện đột biến gen, kiểm nghiệm thực phẩm và phân tích vi sinh vật.

Nhược điểm

Phương pháp này có một số hạn chế như tín hiệu nền cao và nguy cơ dương tính giả do hiện tượng nối không đặc hiệu khi không có ADN mạch khuôn. Ngoài ra, người ta cũng gặp khó khăn trong bước bất hoạt các sản phẩm sau phản ứng và thiếu biện pháp kiểm soát nhiễm hiệu quả. Hơn nữa, mặc dù phản ứng chuỗi ligase có thể phát hiện nhiều loại virus và vi khuẩn nhưng hiện nay chưa có nhiều bộ kit thương mại được phát triển dựa trên công nghệ này.

Lời kết

Phản ứng chuỗi ligase là công nghệ nhân bản ADN với nhiều ưu điểm vượt trội như độ đặc hiệu cao, chi phí thấp, dễ thực hiện và có khả năng kết hợp với nhiều phương pháp phân tích. Người ta đã và đang ứng dụng kỹ thuật này trong chẩn đoán vi sinh vật, phát hiện virus, sàng lọc đột biến gen, nghiên cứu y sinh học. Hiện nay các nghiên cứu về công nghệ này vẫn đang được tiến hành nhằm khắc phục các nhược điểm, đồng thời mở rộng tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác.