Kĩ thuật đo khả năng tiếp cận chromatin: ATAC-seq

Chromatin và khả năng tiếp cận chromatin

Chromatin là cấu trúc phức tạp với vai trò bảo vệ ADN bên trong nhân tế bào. Cấu trúc này được tạo thành khi ADN quấn quanh các protein histone. Cụ thể, một nucleosome bao gồm khoảng 147 cặp base (đơn vị cấu trúc tạo thành ADN) quấn vòng quanh một nhóm gồm 8 phân tử histone. Các nucleosome nối tiếp nhau tạo nên sợi chromatin. Chromatin tiếp tục gấp cuộn nhiều lần để phân tử ADN nằm gọn trong nhân tế bào.

Chromatin có khả năng kiểm soát quá trình biểu hiện gen của tế bào. Khi chromatin bị nén chặt (trạng thái đóng), các protein liên quan đến quá trình phiên mã và điều hòa gen không thể tiếp cận ADN. Từ đó, quá trình sản xuất protein từ gen không thể diễn ra. Ngược lại, khi cấu trúc chromatin được nới lỏng (trạng thái mở), các protein chức năng dễ dàng liên kết để bắt đầu quá trình biểu hiện gen. Người ta gọi khả năng các protein bám vào sợi ADN là khả năng tiếp cận chromatin (chromatin accessibility).

Khả năng tiếp cận chromatin có tầm quan trọng với nghiên cứu quá trình biểu hiện gen, biệt hóa tế bào và bệnh lí. Do đó, người ta nỗ lực phát triển các công cụ nhằm đo lường và hiểu rõ hơn về cấu trúc và chức năng của chromatin.

ATAC-seq

ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing) là một kỹ thuật sinh học phân tử nhằm đánh giá và phân tích những vùng nhiễm sắc thể có độ mở rộng cao. Đây là những vùng ADN có khả năng tiếp cận và tương tác cao với các enzyme và yếu tố điều hòa. Phương pháp này dựa vào kĩ thuật giải trình tự thế hệ mới (NGS) nhằm xác định trình tự ADN.

ATAC-seq được công bố lần đầu tiên vào năm 2013 bởi một nhóm các nhà nghiên cứu do Howard Chang và William Greenleaf dẫn đầu tại Đại học Standford. Cho đến nay, phương pháp này đã trở thành công cụ quan trọng trong nghiên cứu sinh học phân tử và di truyền.

Nguyên lí hoạt động

Kĩ thuật ATAC-seq sử dụng một loại enzyme đặc biệt có tên là Tn5 transposase. Trên phân tử protein này, người ta gắn thêm hai đoạn trình tự đặc biệt được gọi là adapter. Đoạn adapter giữ vai trò thiết yếu trong quá trình giải trình tự. Mỗi đoạn ADN cần liên kết với adapter khác nhau tại hai đầu, sau đó chúng được tiến hành giải trình tự.

Enzyme Tn5 transposase có khả năng phân cắt ADN và gắn các đoạn adapter vào hai đầu của đoạn vừa cắt. Khi ADN cuộn chặt với histone (chromatin đóng), các phân tử enzyme không thể tiếp cận với ADN nên quá trình phân cắt không diễn ra.

Đối với vùng chromatin mở, quá trình giải trình tự được tiến hành do Tn5 transposase có thể tiếp cận dễ dàng. Sau khi thu nhận thông tin các đoạn được giải trình tự, người ta so sánh với trình tự toàn bộ bộ gen tham chiếu. Từ đó, những đoạn ADN liên kết yếu với histone được ghi nhận. Tập hợp các protein liên quan đến điều hòa và biểu hiện gen có khả năng cao liên kết với ADN tại những vùng này. Do đó, các nhà nghiên cứu có thể dự đoán và hiểu rõ hơn về cơ chế điều hòa hoạt động gen trong tế bào.

Qui trình thực hiện

ATAC-seq được thực hiện theo những bước cơ bản sau:

• Tế bào được li giải rồi tách chiết nhân
• Mẫu được ủ với enzyme transpose Tn5 đã được gắn thêm các đoạn adapter. Enzyme sẽ liên kết và cắt những vùng ADN liên kết lỏng lẻo với histone, đồng thời gắn adapter vào hai đầu đoạn ADN vừa mới cắt
• Khuếch đại số lượng các đoạn ADN bằng phương pháp PCR
• ADN được giải trình tự bằng NGS
• Các trình tự được so sánh với bộ gene tham chiếu nhằm xác định các vùng chromatin mở trên toàn bộ gen

Ứng dụng ATAC-seq

Nghiên cứu các bệnh lí liên quan đến rối loạn điều hòa biểu hiện gen

ATAC-seq có thể được sử dụng để xác định và nghiên cứu các bệnh lí bao gồm ung thư, bệnh tiểu đường loại 2, Alzheimer, viêm khớp, động mạch vành, viêm khớp dạng thấp, Parkinson và xơ cứng bì.

Trong những trường hợp này, bệnh xảy ra do bất thường điều hòa biểu hiện gen, không phải do đột biến. Đối với ung thư không đột biến gen, những biến đổi trong cấu trúc chromatin có thể ngăn chặn biểu hiện một số gen quan trọng. Các gen này có khả năng kiểm soát hoạt động của nhiều gen khác, ngăn tế bào tăng sinh quá mức để hình thành ung thư. Kĩ thuật ATAC-seq có thể được sử dụng nhằm phát hiện các thay đổi trong cấu trúc chromatin, từ đó nguyên nhân gây bệnh được xác định.

Nghiên cứu biệt hóa tế bào

Tất cả các tế bào trong cơ thể đều mang cùng một bộ gen, tuy nhiên, mỗi loại tế bào lại có chức năng và hình thái riêng biệt. Chúng được quy định bởi sự biểu hiện gen khác nhau trong quá trình phát triển, cơ chế này được gọi là biệt hóa tế bào. Bằng cách phân tích vùng chromatin mở (nơi các gen đang hoạt động), ATAC-seq có thể phân biệt được mẫu hình đặc trưng của từng loại tế bào khác nhau. Ngoài ra, các nhà khoa học có thể dựa vào ATAC-seq nhằm xác định các vùng nào trên nhiễm sắc thể tham gia vào quá trình biệt hóa của từng loại tế bào cụ thể.

Ưu điểm và hạn chế của ATAC-seq

Ưu điểm

ATAC-seq được tin cậy và ứng dụng rộng rãi do một số ưu điểm nổi bật sau:

• Yêu cầu lượng mẫu ít: ATAC–seq chỉ cần khoảng 50.000 tế bào hoặc ít hơn đối với kỹ thuật phân tích đơn bào (scATAC-seq). Do đó, chúng rất thuận lợi cho nghiên cứu các loại tế bào hiếm gặp hoặc mẫu vật quý hiếm
• Độ nhạy cao: enzyme đặc biệt được sử dụng trong ATAC-seq có khả năng đánh dấu hiệu quả các vùng chromatin mở nhằm phát hiện những thay đổi nhỏ về khả năng tiếp cận của chromatin
• Quy trình đơn giản: so với các kĩ thuật liên quan đến giải trình tự như ChIP-seq hay RNA-seq, ATAC-seq có qui trình thực hiện đơn giản hơn, ít bước thực hiện, giảm nguy cơ mất mẫu và sai số

Ngoài ra, ATAC-seq được ứng dụng trong phân tích đơn bào (scATAC-seq). Phần lớn các phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử hiện nay đều sử dụng cỡ mẫu mẫu lớn lên đến hàng triệu tế bào. Tuy nhiên, mỗi tế bào là một đơn vị riêng biệt và có thể mang những đặc điểm khác nhau. Khi được thu thập trên toàn bộ quần thể, dữ liệu thể hiện giá trị trung bình của tất cả các tế bào. Do đó, mức độ khác biệt giữa các tế bào riêng lẻ không được ghi nhận dẫn đến những tương tác diễn ra trong một số nhóm tế bào nhỏ trong mẫu có thể bọ bỏ sót.

Ví dụ, trong một khối u, mỗi tế bào ung thư có thể mang những đột biến di truyền khác nhau, dẫn đến khác biệt về đáp ứng với điều trị hoặc khả năng di căn. Hơn nữa, trong quá trình phát triển của một sinh vật, tế bào có thể trải qua các giai đoạn phát triển khác nhau tại cùng một thời điểm, ATAC-seq có thể được áp dụng cho từng tế bào nhằm nhận biết được những điểm không đồng nhất giữa các tế bào đơn lẻ trong cùng một quần thể.

Hạn chế

ATAC-seq là kỹ thuật mới với một số hạn chế như sau:

• Enzyme Tn5 transposase gắn hai đoạn adapter lên trên ADN một cách ngẫu nhiên. Trong một số trường hợp, đoạn ADN mang trình tự adapter giống nhau tại hai đầu. Những đoạn ADN này không có khả năng được nhân lên và giải trình tự
• Enzyme Tn5 đôi cắt ADN tại các vị trí liên kết protein điều hòa nên người ta chưa thể thu được thông tin về liên kết giữa protein điều hòa và ADN
• Dữ liệu ATAC-seq chứa nhiều đoạn trình tự có nguồn gốc từ ADN ti thể (20–80% tùy loại tế bào) nên sai lệch trong quá trình phân tích có thể xảy ra

Lời kết

ATAC-seq đã trở thành công cụ không thể thiếu trong nghiên cứu điều hoà phiên mã genome và cấu trúc chromatin. Bằng cách xác định các vùng mở của chromatin trên toàn bộ genome, ATAC-seq cung cấp thông tin chuyên sâu về quá trình điều hòa biểu hiện gen trong các tế bào và mô khác nhau. Kết hợp với những kỹ thuật khác, ATAC-seq hỗ trợ giải đáp các vấn đề liên quan đến sự phát triển, chức năng và đáp ứng với các yếu tố môi trường của cơ thể.