Sắc kí khối phổ song song và ứng dụng trong sàng lọc sơ sinh

Hiện nay, y học “3P” đang phát triển mạnh mẽ với ba tiêu chí bao gồm predictive (dự đoán), preventive (phòng ngừa), personalized (cá thể hóa). Điều này kéo theo tiến bộ vượt bậc của proteomic—một lĩnh vực nghiên cứu toàn bộ hệ protein của sinh vật, cơ quan, mô hoặc tế bào.

Proteomic được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh học và lâm sàng cũng như trong sàng lọc, chẩn đoán bệnh. Phương pháp có thể phát hiện chính xác bệnh nhằm đưa ra phác đồ điều trị hiệu quả, giảm tỷ lệ tử vong đối với nhiều bệnh lí.

Kĩ thuật đo khối phổ song song (Tandem mass spectrometry – MS/MS) là một trong những phương pháp quan trọng của proteomic. MS/MS cho phép xác định các hợp chất chưa biết và định lượng những hợp chất đã biết. Khối phổ cung cấp thông tin về cấu trúc và khối lượng phân tử. Từ đó, kỹ thuật viên có thể phân tích, kiểm tra tương tác, biến đổi của chúng nhằm xác định cấu trúc phân tử trong điều kiện sinh lí và bệnh lí.

Đo khối phổ MS là gì?

Phép đo khối phổ (Mass Spectrometry – MS) dùng để đo tỉ lệ khối lượng phân tử trên điện tích (m/z) của các ion. Trong đó m là trọng lượng phân tử của ion được tính bằng dalton (Da) và z là số lượng điện tích. Đối với phân tử nhỏ (m<1000 Da) thường chỉ có một điện tích. Do đó, tỉ lệ m/z chính bằng khối lượng phân tử của ion.

Khối phổ cung cấp cả thông tin định tính (cấu trúc axit amin/peptide) và định lượng (khối lượng phân tử hoặc nồng độ) nhiều phân tử chất mẫu sau khi được ion hóa.

Quy tắc chung của MS/MS là sự di chuyển có chệch hướng của các phân tử ion dưới tác động của điện trường và từ trường.

Nguyên lý hoạt động của đo khối phổ

Một khối phổ kế gồm 3 thành phần chính:

• Nguồn phát ion (ion source): mẫu được nạp vào máy, bộ phận này tiến hành ion hóa các chất trong mẫu
• Bộ phận phân tích dữ liệu (mass analyzer): ion được phân loại dựa theo tỉ lệ khối lượng trên điện tích (m/z) của chúng
• Đầu dò tín hiệu (detector): lượng ion được đo và hiển thị trên biểu đồ khối phổ

Chuẩn bị mẫu

Mẫu trước khi được phân tách cần chuẩn bị cho quá trình ion hóa trong nguồn phát ion. Các chất có thể dưới dạng lỏng hoặc khí nhờ phương pháp sắc kí:

• Sắc kí khí (Gas Chromatography – GC): dùng để tách các thành phần của hỗn hợp khí dựa trên hình dạng, kích thước, trọng lượng phân tử và điểm sôi. Do đó, mẫu cần được pha loãng và hóa hơi trong sắc kí. Sau khi được phân tách, tập hợp nhiều chất khí đi vào khối phổ kế để phân tích.
• Sắc kí lỏng (Liquid Chromatography – LC): phân tách các thành phần mẫu dựa trên tương tác giữa pha động và pha tĩnh. Ví dụ, giấy lọc (pha tĩnh) được đặt vào hỗn hợp chất lỏng gồm nhiều chất khác nhau (pha động). Những phân tử trong pha động di chuyển trong pha tĩnh nhờ lực mao dẫn. Quá trình di chuyển phụ thuộc vào hình dạng, kích thước độ phân cực của phân tử và mức độ cản trở của pha tĩnh (những cấu trúc sợi cellulose trong giấy lọc).

Ion hóa

Đầu tiên, các nguyên tử và phân tử trong mẫu vật được ion hóa trong nguồn phát ion. Máy khối phổ kế chỉ hoạt động với ion mang điện tích dương (gọi là cation). Do đó, hợp chất được loại bỏ bớt electron trở thành cation.

Kỹ thuật ion hóa phụ thuộc vào loại sắc kí được sử dụng trong khối phổ kế:

• Khối phổ sắc kí khí (GC/MS): ion hóa điện tử (Electron Ionization – EI) được sử dụng nhằm bắn phá các chất trong mẫu bằng nguồn electron năng lượng cao. Từ đó, phân tử mẫu bị phân mảnh thành những ion đặc trưng dựa trên cấu trúc của chúng.
• Khối phổ sắc kí lỏng (LC/MS): ion hóa tia điện (Electrospray Ionization – ESI) và ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization – APCI) là những phương pháp thường được sử dụng.

Đối với ion hóa tia điện ESI, ion trong dung dịch được chuyển đổi thành pha khí theo 3 bước cơ bản. Đầu tiên, dung dịch được phân tán thành các giọt điện tính cực nhỏ. Sau đó, những giọt này được làm bay hơi dung môi. Cuối cùng, ion được phóng ra khỏi các giọt tích điện cao. Từ đó, phân tích ion bằng ESI/MS có độ nhạy cao hơn.

Phân tích các chất

Tất cả các ion từ nguồn phát tiếp tục đưa vào bộ phận phân tích mass analyzer. Trong bộ phận này, dòng phân tử được gia tốc đến khi có cùng động năng nhờ tác dụng của điện trường.

Phân tử ion mang điện tích, do đó chúng chịu ảnh hưởng của từ trường (như 2 nam châm cùng cực sẽ đẩy nhau). Từ trường làm lệch hướng chuyển động của ion, cụ thể:

• Khối lượng tỉ lệ nghịch với độ lệch
• Điện tích tỉ lệ thuận với độ lệch

Ví dụ, ion có khối lượng nhỏ sẽ bị đẩy lệch nhiều hơn trong thiết bị so với ion có khối lượng lớn. Phân tử có điện tích lớn cũng lệch nhiều hơn so với phân tử ít điện tích. Từ đó, máy khối phổ có thể phân tích các ion dựa trên tỷ lệ khối lượng trên điện tích m/z của chúng.

Hệ thống phân tích được sử dụng phổ biến là khối tứ cực (the quadrupole mass analyser) nhằm làm ổn định hoặc mất ổn định quỹ đạo các ion một cách có chọn lọc. Hệ thống này bao gồm 4 thanh hình trụ đặt song song và cách đều nhau được nối điện áp. Các ion di chuyển từ nguồn phát vào trong tứ cực. Quỹ đạo di chuyển ổn định đến được đầu dò chỉ khi ion có tỉ lệ m/z nhất định phù hợp với tỉ lệ điện áp của tứ cực. Những ion còn lại không giữ được quỹ đạo sẽ va đập vào 4 thanh của hệ thống.

Đầu dò phát hiện

Đầu dò (detector) được đặt ở cuối thiết bị, nơi có thể định lượng và loại bỏ một số ion nhất định. Chúng ghi lại điện tích hoặc dòng điện được tạo ra khi một ion chạm vào bề mặt.

Khối phổ song song là gì?

Khối phổ song song còn gọi là MS/MS hay MS2 là hệ thống gồm một hoặc nhiều thiết bị phân tích có khả năng tạo ra nhiều vòng khối phổ. Từ đó, mức độ đo lường chất tăng lên đáng kể.

MS/MS là dạng đơn giản nhất của hệ thống khối phổ song song bao gồm 2 máy khối phổ kế (kí hiệu là MS1 và MS2). Hai khối phổ kế này được nối với nhau bởi 1 buồng va chạm. Các chất trong mẫu ban đầu được phân loại và đo lượng trong MS1. Sau đó, chúng bị phá vỡ thành nhiều mảnh trong buồng va chạm. Cuối cùng, MS2 phân loại và đo lường những mảnh vỡ này.

Phép đo khối phổ song song (MS/MS) cho phép phân mảnh protein và peptide nhằm xác định trình tự axit amin của chúng. Ngoài ra, MS/MS các biến đổi sau dịch mã (post-translational modifications–PTM) của protein và peptide.

Bộ phân tích tứ cực song song

Bộ phân tích của MS/MS có thể được ứng dụng hệ thống 3 tứ cực. Hệ thống này bao gồm 3 bộ tứ cực (kí hiệu là Q1, Q2, Q3) được sắp liên tục, mỗi giai đoạn có vai trò riêng biệt.

Tứ cực đầu tiên Q1 có vai trò chọn lọc những ion cụ thể dựa trên khối lượng phân tử (gọi là ion tiền thân–precursorion) và truyền cho tứ cực thứ 2 Q2. Tại đây, các ion tiền thân va chạm với chất khí khiến chúng phân mảnh thành nhiều phần nhỏ hơn. Tứ cực Q2 tiến hành phân tích những phần nhỏ này và truyền cho tứ cực Q3. Thông tin cấu trúc của ion phân tử được ghi nhận tại tứ cực Q3 này.

Ứng dụng MS/MS trong sàng lọc sơ sinh

Sàng lọc sơ sinh là quá trình kiểm tra sức khỏe của bé bao gồm một loạt các xét nghiệm. Mục đích nhằm xác định các bất thường lâm sàng tiềm ẩn (không biểu hiện rõ ràng) nhưng có khả năng ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe của bé.

Sàng lọc sơ sinh bao gồm phát hiện các rối loạn chuyển hóa, bất thường thính giác và sàng lọc những vấn đề tim. Đối với rối loạn chuyển hóa, sắc kí khối phổ song song được ứng dụng rộng rãi.

Khối phổ song song kết hợp sắc kí lỏng (LC MS/MS) dùng để sàng lọc đa enzyme trên trẻ sơ sinh thông qua đốm máu khô trên giấy lọc đặc biệt. Phương pháp này cho phép phân tích đến 60 chất chuyển hóa bao gồm axit amin, acylcarnitine. Từ đó, bác sĩ có thể sàng lọc 30 bệnh khác nhau chỉ bằng một xét nghiệm.

Những nhóm bệnh chính có thể được phát hiện bằng MS/MS:

• Nhóm bất thường chuyển hóa axit amin (Aminoacidopathies – AA)
• Nhiễm toan máu (Organic Acidemia – OA)
• Rối loạn oxy hóa axit béo (Fatty Acid Oxidation Disorder – FAOD)
• Rối loạn chuyển hóa carbohydrate
• Nhiều bệnh liên quan khác

Hiện nay, MS/MS được tự động hóa dẫn đến giảm chi phí và thời gian sàng lọc. Do đó, kỹ thuật này được ứng dụng rộng rãi với độ chính xác cực cao. Người ta ước tính tỉ lệ dương tính giả giảm từ 1,5% xuống còn 0,26% khi sử dụng khối phổ song song so với sàng lọc truyền thống.

Lời kết

Phép đo khối phổ dùng để phân tích các chất thành phần trong mẫu dựa vào tỉ lệ phân tử khối trên điện tích m/z. Khối phổ song song là tập hợp nhiều máy đo khối phổ nhằm tăng mức độ chính xác trong phát hiện và định lượng. Phương pháp này có thể kiểm tra trình tự axit amin cũng như biến đổi sau dịch mã của peptide.

Thông qua khối phổ song song MS/MS, hơn 30 bệnh rối loạn chuyển hóa của trẻ sơ sinh có thể được sàng lọc chỉ bằng một xét nghiệm. Mẫu được sử dụng là máu gót chân thấm trên giấy lọc đặc biệt. Sàng lọc sơ sinh nên được thực hiện cho tất cả trẻ em nhằm phát hiện sớm và có hướng điều trị kịp thời những bệnh liên quan.