Công nghệ khuếch đại ADN đẳng nhiệt bằng recombinase polimerase

Recombinase Polymerase Amplification là gì?

Recombinase polymerase amplification (RPA) là kĩ thuật khuếch đại axit nucleic đẳng nhiệt tiên tiến. Kĩ thuật này như giải pháp thay thế hiệu quả cho phản ứng chuỗi polymerase (PCR) truyền thống vì chúng hoạt động tại nhiệt độ ổn định (đẳng nhiệt) và thời gian thực hiện ngắn. RPA sử dụng hệ thống enzyme phức tạp nhằm tạo ra quy trình khuếch đại ADN nhanh chóng và hiệu quả.

Nhờ những ưu điểm vượt trội, kĩ thuật RPA được ứng dụng để chẩn đoán trong môi trường có nguồn lực hạn chế hoặc khi cần kết quả nhanh chóng. Kĩ thuật RPA có thể định dạng nhiều loại sinh vật mục tiêu trên các mẫu khác nhau như mẫu nuôi cấy, các loại dịch cơ thể, mẫu sinh thiết, mô nội tạng, sản phẩm động vật và thực vật.

Nguyên lí hoạt động

Phương pháp RPA hoạt động dựa trên ba thành phần enzyme chính gồm recombinase, ADN polymerase có khả năng tách sợi và các protein gắn sợi đơn (single-stranded ADN binding proteins—SSB). Phản ứng RPA hoạt động trong khoảng nhiệt độ từ 37–42°C.

Thành phần cụ thể tham gia phản ứng bao gồm:

• ADN khuôn mẫu cần khuếch đại
• Cặp mồi đặc hiệu gồm các đoạn nucleotide ngắn nhằm xác định vị trí bắt đầu tổng hợp ADN và đảm bảo tính đặc hiệu của phản ứng khuếch đại
• Enzyme recombinase có nguồn gốc từ protein UvsX của vi khuẩn T4
• ADN polymerase có khả năng tách sợi như Bsu polymerase
• Protein gắn sợi đơn
• ATP và các chất tương tự nucleotide. ATP cung cấp năng lượng cho quá trình khuếch đại. Các nucleotide (dNTPs) là nguyên liệu để tổng hợp ADN mới
• Crowding agent (như polyethylene glycol—PEG) làm các thành phần trong phản ứng tăng khả năng tiếp xúc với nhau, do đó giúp quá trình khuếch đại hiệu quả hơn
• Hệ thống tái tạo ATP gồm creatine kinase và phosphocreatine. Hệ thống này đảm bảo cung cấp năng lượng ATP ổn định cho enzyme recombinase trong suốt quá trình phản ứng.
• Đệm phản ứng thích hợp nhằm cung cấp môi trường hóa học tối ưu cho phản ứng. Môi trường bao gồm pH thích hợp, nồng độ muối và các ion kim loại cần thiết cho enzyme hoạt động

Quá trình khuếch đại bắt đầu khi enzyme recombinase liên kết với mồi oligonucleotide đặc hiệu để tạo thành phức hợp nucleoprotein. Phức hợp này có khả năng quét dọc theo ADN khuôn mẫu sợi kép nhằm tìm kiếm trình tự bổ sung cho mồi. Khi tìm thấy vị trí phù hợp, recombinase tách một phần mạch đôi ADN, qua đó cho phép mồi xâm nhập vào và bắt cặp với trình tự đích trên ADN khuôn mẫu.

Trong quá trình này, các protein gắn sợi đơn (SSB) có chức năng ổn định vùng ADN sợi đơn. SSB liên kết với những đoạn ADN sợi đơn bị tách ra trong quá trình tổng hợp nhằm ngăn chặn sợi ADN tái bắt cặp và bảo vệ chúng khỏi enzyme nuclease phân hủy.

Ngay sau khi mồi bắt cặp, ADN polymerase có khả năng dịch chuyển sợi (như Bsu polymerase hoặc các enzyme tương tự) bắt đầu quá trình tổng hợp ADN. ADN polymerase vừa tổng hợp nên sợi ADN mới, đồng thời chúng có khả năng tách sợi ADN. Đặc tính này cho phép quá trình tổng hợp ADN diễn ra liên tục và không cần bước biến tính nhiệt để tách ADN sợi đôi thành đơn như trong phương pháp PCR truyền thống.

Sau khi tổng hợp hoàn chỉnh các sợi ADN mới, chúng sẽ trở thành ADN khuôn mẫu cho các chu kì khuếch đại tiếp theo. Quá trình này diễn ra liên tục và đồng thời tại nhiều vị trí trên ADN khuôn mẫu, dẫn đến sự số lượng bản sao ADN gia tăng nhanh chóng theo cấp số nhân.

Phương pháp đọc kết quả

Phát hiện RPA bằng điện di

Điện di trên gel agarose là phương pháp đơn giản nhất để đọc kết quả công nghệ RPA. Sau khi phản ứng khuếch đại hoàn thành, người ta phân tách sản phẩm trên gel agarose, sau đó nhuộm bằng ethidium bromide. Ethidium bromide có thể len lỏi vào giữa các base của sợi ADN mạch đôi và phát quang khi gặp tia UV, do đó tạo thành các vạch sáng trên gel nếu quá trình khuếch đại thành công.

Tuy nhiên, các thành phần khác trong phản ứng RPA có thể ảnh hưởng đến quá trình sản phẩm di chuyển trên gel, dẫn đến làm mờ hoặc nhòe các vạch sáng. Vì vậy, người ta sử dụng thêm phenol và chloroform tinh sạch sản phẩm khuếch đại trước khi điện di để khắc phục hiện tượng này. Tuy phương pháp điện di di trên gel agarose đơn giản và dễ thực hiện, chúng mất nhiều thời gian và có độ nhạy thấp hơn so với các phương pháp khác.

RPA kết hợp với que thử dòng chảy bên (recombinase polymerase amplification-lateral flow dipstick—RPA-LFD)

Hệ thống RPA-LFD tích hợp các thành phần chính bao gồm enzyme endonuclease ADN (nfo), đầu dò nfo đặc hiệu, và mồi ngược gắn với biotin. Phương pháp này đọc kết quả dựa trên tương tác giữa sản phẩm khuếch đại và kháng thể nhận biết phân tử phát huỳnh quang. Phân tử này được cố định trên màng nitrocellulose của que thử.

Đầu dò nfo có 3 phần gồm kháng nguyên có khả năng tương tác với thuốc nhuộm (bản chất là kháng thể) tại đầu 5’, nhóm chặn tại đầu 3′ và một nucleotide dSpacer tại vị trí trung tâm. Trong đó, nhóm chặn có chức năng ngăn enzyme ADN polymerase kéo dài đầu dò, qua đó đảm bảo đầu dò không hoạt động như một loại mồi khi chưa gắn với ADN mục tiêu.

Khi đầu dò nhận biết và liên kết với ADN mục tiêu, enzyme nfo xúc tác phản ứng cắt tại vị trí dSpacer. Lúc này, đầu dò hoạt động như một loại mồi nhằm khuếch đại sản phẩm mục tiêu. Bên cạnh đó, người ta còn thiết kế một mồi khác (mồi ngược) gắn thêm biotin. Do vậy, sản phẩm ADN khuếch đại sẽ được đánh dấu tại hai đầu bằng kháng nguyên và biotin.

Sau đó, sản phẩm khuếch đại di chuyển dọc theo que thử. Lúc này, kháng nguyên trên đoạn ADN khuếch đại liên kết với thuốc nhuộm trên màng tạo thành phức hợp ADN–thuốc nhuộm. Tại vùng phát hiện, người ta bổ sung các phân tử streptavidin. Các phân tử này bắt lấy biotin trên đầu còn lại của ADN và giữ phức hợp ADN–thuốc nhuộm tại đây, do đó tạo thành một vạch đỏ trên màng. Đồng thời, những phân tử thuốc nhuộm dư tiếp tục di chuyển và bị giữ lại tại vùng kiểm soát, tạo thành vạch màu thứ hai trên que thử.

Nếu như ADN mục tiêu được khuếch đại thành công, trên que thử sẽ xuất hiện 2 vạch màu có thể nhận biết bằng mắt thường. Tuy phương pháp RPA-LFD có ưu điểm nổi bật về tốc độ, tính đơn giản và khả năng ứng dụng trong chẩn đoán tại chỗ, chúng vẫn có hạn chế về độ nhạy.

Phát hiện huỳnh quang thời gian thực

Phương pháp phát hiện huỳnh quang thời gian thực hoạt động dựa trên cơ chế kết hợp giữa enzyme endonuclease và đầu dò oligonucleotide đặc biệt. Cấu trúc đầu dò gồm một cặp nucleotide thymine gắn với một phân tử phát huỳnh quang (fluorophore) và một phân tử dập tắt huỳnh quang (quencher), hai phân tử này được ngăn cách bằng một phân tử tetrahydrofuran (THF). Phân tử THF có chức năng như vị trí nhận diện cho enzyme endonuclease thực hiện phản ứng cắt. Do phân tử phát huỳnh quang nằm gần phân tử dập tắt, tín hiệu huỳnh quang không xuất hiện.

Khi đầu dò lai với sản phẩm khuếch đại RPA, enzyme endonuclease sẽ nhận diện và cắt đứt liên kết tại vị trí THF. Quá trình này giải phóng phân tử phát huỳnh quang khỏi phân tử dập tắt, dẫn đến phát sinh tín hiệu huỳnh quang. Người ta ghi nhận cường độ huỳnh quang liên tục trong suốt quá trình phản ứng, do đó cho phép định lượng sản phẩm khuếch đại theo thời gian thực.

Ưu điểm nổi bật của phương pháp này bao gồm độ nhạy cao, thời gian phát hiện nhanh và tính ứng dụng cao từ chẩn đoán y khoa đến kiểm tra an toàn thực phẩm. Bên cạnh đó, cường độ tín hiệu huỳnh quang tỉ lệ thuận với số lượng sản phẩm khuếch đại nên phương pháp này có thể định lượng chính xác lượng ADN trong mẫu.

Ứng dụng công nghệ RPA

Công nghệ RPA được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như phát hiện đột biến gen, kiểm tra nguồn nước, đánh giá an toàn thực phẩm, phát hiện bệnh truyền nhiễm trên người cũng như các mầm bệnh phổ biến trong nông nghiệp.

Phát hiện vi khuẩn và sinh vật gây bệnh

Công nghệ RPA là một bước đột phá trong phát hiện nhanh và chính xác các vi khuẩn gây bệnh. Ví dụ, phương pháp Real time RPA với đầu dò exo có thể phát hiện vi khuẩn E. coli trong vòng 20 phút với ngưỡng phát hiện thấp 0,01 ng/μl. Kết quả này vượt trội hơn hẳn so với phương pháp nuôi cấy truyền thống vốn tốn nhiều thời gian và dễ bị nhiễm khuẩn.

Ngoài ra, người ta đã phát triển cảm biến sinh học dựa trên công nghệ RPA kết hợp với kĩ thuật dải dòng chảy nhằm phát hiện đồng thời nhiều loại vi khuẩn như Vibrio cholerae và Vibrio vulnificus, qua đó mang lại hiệu quả cao trong chẩn đoán tại chỗ.

Phát hiện virus

Công nghệ RPA được áp dụng nhằm phát hiện nhanh nhiều loại virus khác nhau và không gây nhiễm chéo. Bên cạnh đó, công nghệ RPA có thể thực hiện tại chỗ và không cần sử dụng các thiết bị phức tạp.

Người ta đã thiết kế một phương pháp kết hợp công nghệ RPA với phiên mã ngược để phát hiện virus H5N1 với độ nhạy cao, có thể phát hiện một bản sao RNA duy nhất của virus. Phương pháp khác tích hợp công nghệ RPA và phát hiện huỳnh quang thời gian thực nhằm phát hiện nhanh virus corona mới, phương pháp này cho kết quả trong vòng 15–20 phút. Công nghệ RPA cũng được ứng dụng trong phát hiện virus đậu mùa khỉ, virus Newcastle, virus bệnh phù mùa xuân của cá chép, virus dịch tả lợn châu Phi, virus parvo của chó và nhiều loại khác.

Phát hiện kí sinh trùng

Công nghệ RPA được ứng dụng trong phát hiện các loại kí sinh trùng như động vật nguyên sinh, giun tròn, sán lá và nhiều loại khác. Người ta đã phát triển phương pháp RPA-LFD để khuếch đại đoạn gen 18S rRNA của kí sinh trùng sốt rét, phương pháp này có độ đặc hiệu và độ nhạy cao, do vậy phù hợp kiểm tra tại chỗ đối với các khu vùng sâu vùng xa, qua đó góp phần vào công tác phòng chống sốt rét toàn cầu.

Ngoài ra, người ta cũng ứng dụng phương pháp RPA-LFD trong chẩn đoán bệnh sán máng Nhật Bản trên chuột và cừu. Do phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, không có phản ng chéo với các loại sán lá khác đối với mẫu âm tính.

Đánh giá an toàn thực phẩm

Công nghệ RPA được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực an toàn thực phẩm với hai ứng dụng chính gồm phát hiện vi khuẩn gây bệnh và sàng lọc thực phẩm biến đổi gen.

Dựa trên công nghệ RPA, người ta thiết lập xét nghiệm phát hiện Vibrio parahaemolyticus—một loại vi khuẩn gây bệnh đường ruột thường hiện diện trong thực phẩm biển nhiễm bẩn. Đối với tác nhân gây bệnh tả Vibrio cholerae, người ta đã phát triển phương pháp RPA kết hợp với kĩ thuật phát hiện huỳnh quang thời gian thực để phát hiện chúng. Phương pháp này có độ nhạy rất cao vì có khả năng phát hiện 5 bản sao ADN vi khuẩn trong 20 phút.

Ngoài ra, công nghệ RPA còn được sử dụng nhằm sàng lọc và phát hiện cây trồng biến đổi gen. Người ta đã kết hợp phương pháp phát hiện huỳnh quang thời gian thực và RPA-LFD nhằm phát hiện đậu nành biến đổi gen. Bên cạnh đó, RPA cũng được sử dụng để phát hiện bắp biến đổi gen trong vòng 30 phút với độ nhạy cao.

Phát hiện gen kháng thuốc

Thực trạng lạm dụng kháng sinh của con người đã làm tăng khả năng kháng thuốc, do đó tạo ra thách thức lớn cho ngành y tế. Công nghệ RPA có thể phát hiện các gen kháng thuốc nhanh chóng và chính xác, do đó giúp bác sĩ đưa ra phương pháp điều trị phù hợp, đồng thời góp phần làm chậm quá trình xuất hiện các chủng vi khuẩn kháng thuốc mới. Ví dụ, người ta ứng dụng RPA nhằm phát hiện gen blaoxa-23 kháng carbapenem của vi khuẩn Acinetobacter baumannii và gen kháng methicillin của tụ cầu khuẩn (MRSA).

Phát hiện nấm

Trong lĩnh vực phát hiện nấm, công nghệ RPA đã mang lại bước tiến đáng kể so với các phương pháp truyền thống. Thông thường, phương pháp quan sát hình thái và đặc điểm sinh lí của nấm tốn nhiều thời gian và có tỉ lệ dương tính thấp. Công nghệ RPA đã giải quyết hiệu quả những hạn chế này.

Đối với Candida albicans—một loại nấm phổ biến gây nhiễm nấm âm đạo, người ta đã phát triển phương pháp RPA giúp phát hiện loại nấm này với độ chính xác lên đến 100%. Trong lĩnh vực nông nghiệp, người ta kết hợp RPA với công nghệ CRISPR/Cas12a để phát hiện nấm Leptosphaeria maculans gây hại cho cây cải dầu trong thời gian ngắn (45 phút).

Ưu nhược điểm

Ưu điểm

• Thời gian thực hiện nhanh, kết quả nhận được trong vòng 5–15 phút khi sử dụng đầu dò huỳnh quang hoặc 20–35 phút với que thử dòng chảy bên
• Tính linh hoạt cao, công nghệ RPA có thể tương thích với nhiều phương pháp đọc kết quả khác nhau
• Giảm nguy cơ lây nhiễm chéo
• Tính ứng dụng cao, công nghệ RPA không yêu cầu thiết bị phức tạp, chúng có thể thực hiện tại nhiệt độ cơ thể với các hóa chất khô dễ dàng vận chuyển và bảo quản

Nhược điểm

• Trình tự mồi và đầu dò dài hơn so với các kĩ thuật khác, do đó chúng có thể làm tăng chi phí thực hiện
• Hạn chế trong khuếch đại đa mồi
• Độ đặc hiệu không cao bằng một số phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt khác

Lời kết

Công nghệ RPA có vai trò quan trọng đối với lĩnh vực chẩn đoán phân tử và nghiên cứu sinh học. Công nghệ này giúp phát hiện nhanh tác nhân gây bệnh và kiểm soát an toàn thực phẩm. Tuy công nghệ RPA còn một số hạn chế cần khắc phục, chúng có thể mở rộng phạm vi ứng dụng trong lương lai và tiềm năng trở thành công cụ chẩn đoán tại chỗ quan trọng.