Công nghệ microarray

Giới thiệu về microarray

Microarray (vi mảng) là công nghệ tiên tiến được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu ung thư, di truyền học, sinh học phân tử và nhiều lĩnh vực khác. Microarray cho phép phân tích biểu hiện của hàng chục nghìn gen trong một mẫu duy nhất nhằm xác định các đoạn ADN hoặc ARN hiện diện trong mẫu. Do đó, nhờ microarray, người ta có thêm kiến thức về gen cũng như ứng dụng vào chẩn đoán và điều trị bệnh.

Cấu tạo của microarray bao gồm một bề mặt phẳng (tấm kính hay nhựa) chứa hàng ngàn điểm nhỏ, mỗi điểm nhỏ gắn các đoạn đầu dò (probe) có bản chất là ADN. Khi mẫu được nhỏ lên bề mặt microarray, đoạn ADN hoặc ARN trong mẫu sẽ kết hợp với đầu dò cố định nhằm tạo ra tín hiệu giúp nhận diện những đoạn gen có trong mẫu. Microarray ARN được sử dụng để đo nồng độ ARN và microarray ADN dùng để đo nồng độ ADN.

Ảnh: Cấu trúc ADN
Nguồn: Labster Theory pages

Nguyên lý hoạt động của microarray

Microarray hoạt động dựa trên liên kết đặc hiệu giữa các đoạn ADN/ARN với đầu dò theo nguyên tắc bổ sung (lai hóa). Mảng microarray giữ lại những phân tử liên kết với đầu dò và phát ra tín hiệu quang học, phân tử không liên kết được sẽ bị rửa trôi đi. Sau đó, người ta phân tích tín hiệu quang học bằng máy tính nhằm xác định những gen hiện diện trong mẫu và mức độ biểu hiện của chúng.

Lịch sử phát triển của microarray

Người ta cho rằng tiền thân của microarray là phương pháp lai ghép khuẩn lạc. Trong phương pháp lai ghép khuẩn lạc, các đoạn ADN mục tiêu được chèn ngẫu nhiên vào plasmid (phân tử ADN dạng vòng) của vi khuẩn E. coli. Sau đó, người ta nuôi cấy vi khuẩn E. coli mang plasmid biến đổi này trên đĩa petri chứa thạch agar và một lớp màng nitrocellulose.

Màng nitrocellulose có khả năng giữ lại ADN của vi khuẩn. Các khuẩn lạc hình thành trên màng nitrocellulose sẽ phá vỡ để giải phóng ADN ra ngoài. Sau đó, ADN này được biến tính, tách thành mạch đơn và gắn chặt vào màng nitrocellulose để tạo ra những đốm ADN riêng biệt. Mỗi đốm ADN đại diện cho một đoạn ADN đã nhân bản. Người ta sử dụng đầu dò ADN hoặc ARN ngắn đánh dấu phóng xạ để tìm đốm ADN có chứa trình tự bổ sung với đầu dò. Sau khi tìm được, đầu dò bắt cặp với đoạn ADN bổ sung và phát ra tín hiệu phóng xạ.

Vào cuối những năm 1990, đầu năm 2000, công nghệ microarray ADN đã có bước tiến triển nhanh chóng khi người ta phát triển phương pháp sản xuất phát hiện huỳnh quang mới. Ngoài ra, những khám phá về trình tự ADN tăng lên giúp cung cấp thông tin để sản xuất các vi mảng. Năm 1995, lần đầu tiên người ta giới thiệu công nghệ vi mảng microarray hiện đại.

Năm 1996, người ta công bố một phương pháp đột phá cho phép tạo ra mảng microarray mật độ cao trên bề mặt kính. Phương pháp này cho phép in hàng ngàn đến hàng triệu điểm ADN trên một diện tích nhỏ, do đó làm tăng khả năng phân tích mức độ biểu hiện gen.

Phân loại microarray

Lai so sánh hệ gen trên vi mạch

Trong quá trình thực hiện, mẫu gồm hai loại là mẫu nghi ngờ bệnh và mẫu tham chiếu khỏe mạnh được đánh dấu bằng chất phát quang có màu khác nhau. Đối với mẫu ARN, người ta chuyển chúng thành cADN, sau đó tiến hành đánh dấu. Mẫu nghi ngờ thường được đánh dấu bằng chất phát quang màu đỏ và mẫu tham chiếu đánh dấu bằng màu xanh lá. Người ta trộn chung hai mẫu và chuyển lên trên bề mặt microarray.

Sau khi cho mẫu kết hợp với đầu dò, người ta sử dụng máy quét huỳnh quang để phát hiện tín hiệu huỳnh quang trên vi mảng. Cường độ tín hiệu sẽ phản ánh mức độ biểu hiện của gen. Nếu một gen trong mẫu nghi ngờ biểu hiện cao hơn so với mẫu mô khỏe mạnh, điểm tương ứng trên vi mảng sẽ xuất hiện màu đỏ. Ngược lại, nếu biểu hiện gen thấp hơn, điểm tương ứng có màu xanh lá. Nếu biểu hiện gen bằng nhau giữa hai mẫu, tín hiệu màu xanh hòa với màu đỏ tạo thành màu vàng.

Vi mạch đa hình đơn nucleotide

Đa hình đơn nucleotide là những biến thể di truyền phổ biến nhất trong quần thể, chúng xảy ra khi một nucleotide đơn lẻ trong ADN bị thay thế bằng nucleotide khác. Vi mạch đa hình đơn nucleotide hoạt động dựa trên cơ chế mẫu ADN liên kết với bảng microarray chứa hàng ngàn probe khác nhau, mỗi probe khác nhau một nucleotide đặc trưng.

Nếu mẫu ADN liên kết hoàn toàn với đầu dò, tín hiệu huỳnh quang phát ra mạnh. Ngược lại, khi trình tự ADN bị thay đổi một nucleotide sẽ dẫn đến giảm khả năng liên kết và tín hiệu phát ra kém. Dựa vào cường độ tín hiệu và trình tự probe, người ta có thể xác định những biến thể đa hình đơn nucleotide trong bộ gen.

Quy trình thực hiện phân tích microarray

Bước 1. Chuẩn bị mảng ADN

Người ta thiết kế các đầu dò ADN và sử dụng robot hoặc phương pháp hóa học để in lên bề mặt phiến kính.

Bước 2. Thu thập mẫu

Thu thập mẫu tế bào/mô khỏe mạnh và mẫu tế bào/mô nhiễm bệnh nhằm tiến hành so sánh.

Bước 3. Tách chiết ADN/mARN

Chiết xuất ADN/mARN từ mẫu tế bào hoặc mô, người ta cần kiểm tra chất lượng để đảm bảo ARN không bị phân huỷ.

Bước 4. Đánh dấu huỳnh quang cho từng mẫu

Đối với mẫu ARN, người ta cần bổ sung enzyme reverse transcriptase nhằm chuyển ARN thành phân tử cADN.

Bước 5. Lai hóa

Đánh dấu cADN của 2 mẫu lên mảng ADN để lai, sau đó rửa trôi các trình tự không liên kết.

Bước 6. Thu thập và phân tích dữ liệu

Sử dụng máy quét mảng để đọc tín hiệu huỳnh quang, phân tích điểm khác biệt về cường độ màu sắc để xác định biểu hiện gen.

Ứng dụng của microarray

Chẩn đoán bệnh di truyền trên trẻ sơ sinh

Bác sĩ và chuyên gia di truyền có thể thực hiện xét nghiệm vi mạch đa hình đơn nucleotide nếu trẻ sơ sinh có các vấn đề về thể chất hoặc trẻ chậm phát triển hành vi và giảm khả năng học tập. Người ta nhận thấy khoảng 25% trẻ em chậm phát triển không rõ nguyên nhân có thể do bất thường nhiễm sắc thể. Những bất thường này không thể phát hiện bằng phân tích nhiễm sắc thể thông thường nhưng chúng có thể phát hiện thông qua vi mạch đa hình đơn nucleotide.

Nghiên cứu

Công nghệ microarray đã trở thành công cụ đa năng trong nghiên cứu sinh học phân tử vì chúng được ứng dụng rộng rãi từ sinh học cơ bản đến y học lâm sàng. Đối với lĩnh vực sinh học cơ bản, microarray có thể xác định và nghiên cứu gen mới trên nhiều sinh vật khác nhau. Ví dụ, người ta có thể sử dụng microarray trong lĩnh vực nông nghiệp nhằm nghiên cứu các gen trên cây trồng liên quan đến khả năng chống chịu côn trùng gây hại, từ đó những biện pháp kiểm soát hiệu quả hơn được phát triển.

Bên cạnh ứng dụng trong nông nghiệp và sinh học cơ bản, microarray có ảnh hưởng quan trọng đối với lĩnh vực y học, đặc biệt trong nghiên cứu và điều trị ung thư. Microarray phân tích và xác định mức độ thay đổi của gen liên quan đến quá trình phát triển khối u, qua đó người ta có thể hiểu rõ hơn cơ chế sinh bệnh học.

Ngoài ra, công nghệ microarray cho phép phân loại chính xác các loại ung thư dựa trên hồ sơ biểu hiện gen, do đó, người bệnh có thể cá nhân hóa quá trình điều trị. Bên cạnh đó, microarray giúp xác định khả năng đáp ứng điều trị của các nhóm bệnh nhân khác nhau nên bác sĩ có thể điều chỉnh phác đồ điều trị theo từng cá nhân nhằm nâng cao hiệu quả và giảm tác dụng phụ không mong muốn.

Mặt khác, microarray có khả năng phát hiện đột biến mất hoặc gen khuếch đại khối u, vì vậy, chúng giúp tăng tính chính xác của kết quả chẩn đoán và hỗ trợ xác định gen tiềm năng cho liệu pháp điều trị mới.

Phát hiện vi sinh vật gây bệnh

Sau khi vi khuẩn chết, ADN của chúng vẫn còn tồn tại trong môi trường. Microarray có thể phát hiện đoạn ADN đặc trưng của từng loại vi khuẩn, qua đó xác định loại vi khuẩn đang hiện diện trong mẫu bệnh phẩm.

Công nghệ microarray cực kì hữu ích khi phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong khoang miệng. Khoang miệng là môi trường sống của nhiều loại vi khuẩn, trong đó có những loại vi sinh vật kị khí gây ra nhiễm trùng. Vi khuẩn kị khí có khả năng sống và phát triển trong môi trường thiếu oxy.

Microarray có thể xác định vi khuẩn kị khí dễ dàng thông qua ADN của chúng thay vì phải nuôi cấy trong phòng thí nghiệm rất khó khăn. Bác sĩ có thể sử dụng microarray để phân tích trực tiếp mẫu bệnh phẩm như nước bọt, máu hoặc mô để xác định nhanh chóng vi khuẩn gây bệnh.

Phát hiện sớm dấu hiệu tiền ung thư miệng

Leukoplakia là mảng trắng hoặc xám trắng trên niêm mạc miệng (lưỡi, nướu, má trong) và trên môi. Leukoplakia có thể là dấu hiệu tiền ung thư, nghĩa là những mảng trắng này có khả năng biến đổi thành ung thư miệng.

Mảng leukoplakia rất nhỏ nên khó nhận biết bằng mắt thường. Khi quan sát chúng dưới kính hiển vi, bác sĩ không thể kết luận được chúng lành tính hay có nguy cơ tiến triển thành ung thư. Công nghệ microarray giúp phân tích hoạt động của hàng ngàn gen hiện diện trong mảng leukoplakia, do đó bác sĩ có thể xác định tế bào ác tính có nguy cơ hình thành ung thư.

An ninh

Microarray giúp phát hiện nhanh chóng và chính xác các tác nhân gây bệnh nguy hiểm như vi khuẩn, virus được sử dụng trong chiến tranh sinh học. Vì vậy, người ta có thể chủ động thực hiện những biện pháp bảo vệ an ninh quốc gia và sức khỏe cộng đồng. Ngoài ra, microarray còn được ứng dụng để phân tích ADN trong lĩnh vực pháp y nhằm hỗ trợ điều tra tội phạm.

Ưu Điểm của Công Nghệ Microarray

• Thời gian thực hiện tương đối nhanh (trong vòng 1 tuần)
• Quá trình xử lí và phân tích dữ liệu của microarray đơn giản, chúng có thể thực hiện trên máy tính thông thường
• Chi phí mẫu microarray thấp hơn so với những công nghệ giải trình tự khác
• Phát hiện thay đổi số lượng bản sao cực nhỏ trong các đoạn ADN trên nhiễm sắc thể, do đó kết quả chẩn đoán bệnh di truyền có độ chính xác cao
• Khả năng xử lí đồng thời lượng lớn mẫu. Hiện nay, công nghệ microarray được tự động hóa, cho phép phân tích hàng nghìn mẫu trong một tháng

Hạn chế

Microarray được thiết kế để nhận diện một số trình tự ADN hoặc ARN cụ thể. Do đó, công nghệ này không thể phát hiện được một số đoạn ADN hoặc ARN trong mẫu nếu trên vi mảng không có đầu dò tương ứng, nghĩa là microarray không thể phân tích biểu hiện gen mới chưa được xác định hoặc đoạn ARN không mã hóa.

Đối với sinh vật có bộ gen đa dạng như vi khuẩn, microarray thường phân tích dựa trên thông tin một chủng tham chiếu nên gen của các chủng vi khuẩn khác có thể bị bỏ sót.

Mặt khác, bộ gen của động vật có vú mang nhiều họ gen, một số gen trong cùng họ có trình tự ADN rất giống nhau. Vì vậy, khi thiết kế microarray, người ta gặp nhiều khó khăn trong chọn lọc đầu dò đặc hiệu cho từng gen. Nếu độ đặc hiệu không đủ, đầu dò có thể bắt cặp bổ sung với nhiều gen khác nhau, dẫn đến kết quả không chính xác.

Microarray cung cấp thông tin nồng độ tương đối của trình tự, chúng không đo lường trực tiếp nồng độ trong mẫu. Tín hiệu huỳnh quang tỉ lệ thuận với nồng độ phân tử trong mẫu. Tuy nhiên, trong thực tế, kết quả này không phải lúc nào cũng phản ánh chính xác nồng độ của các phân tử do nhiều yếu tố khác ảnh hưởng đến quá trình thí nghiệm.

Lời kết

Microarray là công cụ quan trọng đối với nghiên cứu sinh học phân tử. Công nghệ này cho phép người ta phân tích biểu hiện gen trên qui mô lớn, từ đó cung cấp kiến thức về hoạt động của gen trong các điều kiện khác nhau. Tuy microarray có những hạn chế nhất định, chúng vẫn có vai trò then chốt trong chẩn đoán bệnh, nghiên cứu ung thư và phát hiện vi sinh vật gây bệnh. Hiện nay, người ta đang cải tiến microarray để hoàn thiện công nghệ, từ đó ứng dụng chúng vào nhiều lĩnh vực hơn trong tương lai.