Phương pháp miễn dịch kết tủa và giải trình tự adn methyl hóa

Tổng quan

Methyl hóa ADN là dấu ấn di truyền quan trọng đối với nhiều quá trình sinh học, bao gồm phát triển phôi thai, điều hòa gen và hình thành bệnh tật. Quá trình methyl hóa ADN thường diễn ra trên nucleotide cytosine tại carbon số 5, người ta gọi chúng là 5-methylcytosine (5mC).

Kĩ thuật miễn dịch kết tủa ADN methyl hóa (MeDIP) là phương pháp làm giàu các đoạn ADN đã methyl hóa trên toàn bộ hệ gen. Phương pháp này sử dụng các loại kháng thể có khả năng nhận diện đặc hiệu vùng ADN methyl hóa.

MeDIP được kết hợp với công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) để tạo ra phương pháp miễn dịch kết tủa và giải trình tự ADN methyl hóa (DNA immunoprecipitation and sequencing – MeDIP-Seq). Phương pháp này có khả năng giải trình tự sâu và cho phép bao phủ phạm vi rộng lớn của hệ gen. Do đó, MeDIP-Seq tạo điều kiện thuận lợi để phát hiện và phân tích những vùng ADN methyl hóa đã được thu nhận thông qua quá trình kết tủa miễn dịch.

Nguyên lí hoạt động

Người ta phân mảnh ADN thành nhiều đoạn ngắn (khoảng 300–1000 cặp base) rồi biến tính chúng nhằm tạo ra các sợi đơn. Quá trình này làm lộ ra gốc 5-methylcytosine (5mC), do đó, kháng thể tiếp cận dễ dàng hơn tới những vị trí methyl hóa.

Tiếp theo, kháng thể đặc hiệu nhận biết 5mC được thêm vào. Chúng có thể nhận diện và gắn kết chọn lọc với gốc cytosine đã methyl hóa để tạo ra phức hợp kháng thể-ADN. Sau đó, người ta thêm vào dung dịch những hạt từ tính cực nhỏ đã phủ một lớp protein kháng thể thứ cấp. Protein này có khả năng bám chặt vào kháng thể trong phức hợp.

Một nam châm mạnh được sử dụng để kéo hạt từ ra khỏi dung dịch. Do protein kháng thể thứ cấp có thể bám chặt vào kháng thể, hạt từ sẽ mang theo phức hợp kháng thể-ADN ra khỏi dung dịch. Phức hợp kháng thể-ADN được tách ra khỏi hạt từ, sau đó các đoạn ADN methyl hóa được phân chia tiếp ra khỏi kháng thể rồi thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại số lượng bản sao. Sau quá trình khuếch đại, những đoạn ADN này được giải trình tự bằng công nghệ NGS.

Cuối cùng, người ta sử dụng công cụ tin sinh học để so sánh trình tự ADN với hệ gen tham chiếu, qua đó vị trí của các vùng methyl hóa được xác định chính xác. Quá trình này tạo ra một bản đồ chi tiết về mật độ phân bố của vị trí methyl hóa trên toàn bộ hệ gen.

Quy trình thực hiện

Bước 1. Chuẩn bị ADN

• Tách chiết ADN bộ gen từ tế bào hoặc mô nghiên cứu
• Phá vỡ ADN bằng sóng siêu âm thành các đoạn có độ dài khoảng 300 bp
• Điện di trên gel agarose để kiểm tra kích thước đoạn ADN

Bước 2. Gắn kháng thể lên ADN

• Biến tính ADN bằng nhiệt để tạo ra ADN sợi đơn
• Thêm kháng thể đặc hiệu cho 5-methyl-cytidine vào ADN đã biến tính
• Ủ hỗn hợp ADN–kháng thể qua đêm tại 4°C

Bước 3. Gắn hạt từ chứa kháng thể thứ cấp

• Rửa hạt từ có gắn kháng thể thứ cấp
• Thêm hạt từ đã rửa vào hỗn hợp ADN–kháng thể
• Ủ trong 2 giờ tại 4°C

Bước 4. Rửa và loại bỏ kháng thể

• Rửa và tách hạt từ, kháng thể ra khỏi hỗn hợp ADN–kháng thể–hạt từ
• Kháng thể còn sót trên ADN được loại bỏ bằng proteinase K

Bước 5. Tinh sạch ADN

• Tách chiết ADN bằng phenol-chloroform-isoamyl alcohol
• Tủa ADN bằng ethanol
• Rửa và hòa tan ADN trong nước không chứa nuclease

Bước 6. Tạo thư viện ADN và giải trình tự

• Thực hiện các bước chuẩn bị thư viện ADN
• Tiến hành giải trình tự ADN trên máy giải trình tự thế hệ mới

Ứng dụng

MeDIP-seq thường được ứng dụng trong các lĩnh vực sau:

• Nghiên cứu tính không đồng nhất epigenetic
• Khảo sát mối quan hệ giữa môi trường và epigenetic
• Nghiên cứu cơ chế điều hòa biểu hiện gen
• Ứng dụng trong nghiên cứu bệnh lí
• Nghiên cứu dấu ấn di truyền
• Khảo sát quá trình phát triển phôi thai
• Phát hiện vùng giàu ADN methyl hóa trong mẫu bệnh phẩm
• Theo dõi tình trạng ADN methyl hóa trong quá trình phát triển bệnh
• Phân tích so sánh mô hình ADN methyl hóa giữa mẫu bệnh phẩm và bình thường

Ưu điểm của phương pháp MeDIP-seq

Phát hiện nhiều dạng methyl hóa

MeDIP-seq có khả năng phát hiện ADN methyl hóa trên cả hai vị trí CpG và non-CpG (như CpA, CpT, CpC). CpG là thuật ngữ chỉ liên kết phosphodiester giữa cytosine (C) và guanine (G), chúng tương tự đối với các nucleotide còn lại. Thông qua đó, MeDIP-seq cung cấp mô tả toàn diện hơn về trạng thái methyl hóa của bộ gen. Thông tin này rất quan trọng khi nghiên cứu tế bào gốc và tế bào thần kinh—những tế bào chứa nhiều trình tự methyl hóa non-CpG.

Ngoài ra, Phương pháp MeDIP-seq có thể phân biệt 5-methylcytosine (5mC) và hydroxymethyl hóa (5hmC) thông qua kháng thể đặc hiệu. 5hmC là một dạng hydroxymethyl hóa của 5mC, cụ thể, nhóm hydroxymethyl (–CH₂OH) sẽ thay thế nhóm methyl (–CH₃) tại carbon số 5 của cytosine. Hai trạng thái này có chức năng khác nhau đối với quá trình điều hòa biểu hiện gen.

Tính linh hoạt cao và khả năng áp dụng rộng rãi

Trước khi thực hiện phương pháp MeDIP-seq, người ta không cần dự đoán trước vị trí hoặc mô hình methyl hóa. Do vậy, MeDIP-seq có thể ứng dụng rộng rãi cho nhiều loài sinh vật, bao gồm những loài chưa có dữ liệu bộ gen hoàn chỉnh, qua đó giúp mở rộng phạm vi nghiên cứu.

Mặt khác, phương pháp này có thể nhắm mục tiêu toàn bộ gen hoặc một khu vực quan tâm cụ thể, do đó tạo ra tính linh hoạt khi thiết kế thí nghiệm cũng như giảm mức độ chênh lệch giữa kết quả nghiên cứu và thực tế. Người ta có thể so sánh mô hình methyl hóa giữa người bệnh với người khỏe mạnh và không bị giới hạn trên các vùng genome đã xác định.

Hiệu quả về mặt chi phí

MeDIP-seq mang lại hiệu quả chi phí tốt hơn so với phương pháp chuyển đổi bisulfite—tiêu chuẩn vàng để xác định trạng thái methyl hóa ADN hiện nay. MeDIP-seq loại bỏ trước những vùng không mang thông tin methyl hóa, do đó giúp tối ưu hóa nguồn lực và thời gian phân tích.

Bên cạnh đó, MeDIP-seq yêu cầu lượng ADN đầu vào thấp. Vì vậy, phương pháp này phù hợp với những nghiên cứu có lượng mẫu hạn chế hoặc trong các tình huống có ít mẫu sinh học.

Độ chính xác cao

MeDIP-seq có thể phân biệt 5-methylcytosine (5mC) và hydroxymethyl hóa (5hmC), do đó, chúng làm giảm nguy cơ nhiễu thông tin và tăng độ tin cậy của kết quả.

Nhược điểm của phương pháp MeDIP-seq

Độ phân giải còn hạn chế

MeDIP-seq không thể xác định mức độ methyl hóa hay trạng thái bán methyl hóa (một sợi được methyl hóa trên tổng hai sợi ADN) của từng cặp base. Phương pháp này đưa ra kết quả dưới dạng các vùng methyl hóa khác biệt với độ phân giải tối thiểu khoảng 100–150 base.

Chênh lệch mật độ methyl hóa

MeDIP-seq có xu hướng ưu tiên các đoạn ADN có mật độ methyl hóa cao. Do đó, một số vùng có mật độ methyl hóa CpG thấp (dưới 1,5%) có thể không được phát hiện hoặc phát hiện với số lượng thấp hơn thực tế.

Khó khăn khi xác định vùng không methyl hóa

Trái ngược với vùng methyl hóa được phát hiện dễ dàng, người ta thường gặp nhiều khó khăn khi sử dụng MEDIP-Seq để xác định vị trí không methyl hóa.

Chênh lệch kháng thể

Kháng thể có thể chênh lệch với một số trình tự đặc biệt trên ADN. Ví dụ, kháng thể 5mC bám vào các vùng có hàm lượng CG thấp trong khi quá trình methyl hóa thường diễn ra tại trình tự có nhiều CG. Do đó, kết quả phân tích MEDIP-Seq có thể không phản ánh đúng hoàn toàn thực tế về mật độ phân bố và mức độ biến đổi di truyền biểu sinh trong bộ gen.

Lời kết

MeDIP-seq là công cụ mạnh mẽ và linh hoạt trong nghiên cứu methyl hóa ADN. Kĩ thuật này cho phép tìm hiểu quá trình mehthyl hóa toàn diện, xác định các mô hình methyl hóa bất thường trong bệnh lí cũng như hiểu rõ hơn về quá trình điều hòa biểu hiện gen. Tuy vẫn còn một số hạn chế, MeDIP-seq vẫn là công cụ quan trọng để nghiên cứu di truyền học biểu sinh. Trong tương lai, MeDIP-seq hứa hẹn là phương pháp tiềm năng để điều trị y học cá nhân hóa và chẩn đoán phân tử.