Giải trình tự exome lâm sàng (CES)

Giải trình tự exome lâm sàng là gì?

Giải trình tự exome lâm sàng (Clinical Exome Sequencing – CES) là kĩ thuật giải trình tự nhằm xác định các đột biến gây bệnh trên vùng mã hóa protein (exon) của một số gen đã được nghiên cứu.

Exon là một đoạn trình tự nằm trong gen, nó mang thông tin mã hóa tạo ra các protein. Khi gen được phiên mã thành ARN, các đoạn exon được nối lại với nhau để tạo thành mRNA trưởng thành, sau đó chúng được dịch mã thành protein. Đồng thời, các đoạn ADN không mang thông tin mã hóa protein (được gọi là intron) bị loại bỏ trong quá trình xử lí ARN. Các exon chỉ chiếm khoảng 1–2% bộ gene nhưng chúng lại mang phần lớn các đột biến gây bệnh đã biết.

CES chủ yếu tập trung vào giải trình tự gen liên quan đến các bệnh di truyền đã được nghiên cứu rõ ràng và đầy đủ thông tin nhất. CES ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) để phân tích nhanh chóng khối lượng thông tin lớn của ADN, từ đó, ác đột biến gây bệnh trên toàn bộ bộ gen người được xác định.

So với các kỹ thuật giải trình tự phạm vi rộng hơn như giải trình tự toàn bộ exome (Whole Exome Sequencing – WES) và giải trình tự toàn bộ bộ gen (Whole Genomes Sequencing – WGS), CES tập trung hơn vào các vùng có ý nghĩa lâm sàng nhằm chẩn đoán bệnh di truyền hiệu quả. Hiện nay, các xét nghiệm CES có thể bao gồm hơn 100 bệnh thuộc nhiều lĩnh vực như thần kinh học, miễn dịch học và phổi.

Quy trình thực hiện

Thu nhận mẫu

Tế bào được thu nhận từ mẫu máu hoặc mô của bệnh nhân, sau đó, ADN được tách chiết và tinh sạch. Mẫu ADN được kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt về nồng độ, độ tinh khiết và tính nguyên vẹn.

Chuẩn bị thư viện

ADN bộ gen được phân cắt thành các đoạn ngắn hơn bằng tác động cơ học hoặc enzyme cắt giới hạn.

• Biến đổi đầu mút và gắn đuôi A: trong quá trình phân cắt, nhiều đoạn ADN phân mảnh thường có hai đầu mút không đối xứng. Tại bước này, enzyme đặc hiệu được sử dụng nhằm làm bằng các đầu mút. Sau đó, một nucleotide Adenine (A) được thêm vào đầu 3′ của mỗi đoạn ADN bằng enzyme polymerase. Quá trình này tạo ra các đuôi A đơn tại đầu 3′ nhằm tăng khả năng gắn kết với adapter trong bước sau.
• Gắn adapter: adapter được gắn vào những đoạn ADN đã được xử lý. Adapter chứa các trình tự cần thiết cho quá trình phân tích.
• Tinh sạch: các hạt mang từ tính được bổ sung vào mẫu. Chúng có khả năng liên kết với những đoạn ADN có gắn adapter. Sau đó, các hạt này được tách ra khỏi dung dịch bằng từ trường mang theo các đoạn ADN đích. Những thành phần dư thừa khác bị bỏ lại trong dung dịch.
• Phân lập exome: hỗn hợp đầu dò (probe) được bổ sung vào mẫu sau tinh sạch. Đây là những đoạn trình tự được thiết kế và tổng hợp nhằm liên kết đặc hiệu với các trình tự exon mục tiêu trong bộ gen. Sau đó, các phức hợp probe-exon được tách ra và giữ lại, trong khi phần còn lại của mẫu ADN bị loại bỏ.
• Khuếch đại PCR: phản ứng PCR được thực hiện để nhân bản số lượng probe-exon mục tiêu lên nhiều lần nhằm đảm bảo đủ lượng mẫu cho quá trình giải trình tự.

Giải trình tự NGS và phân tích dữ liệu

Sau bước khuếch đại PCR, mẫu được đưa vào máy giải trình tự NGS. Kết quả của quá trình này là thông tin của hàng triệu đoạn trình tự.

Các đoạn đọc trình tự thô được sắp gióng với bộ gen tham chiếu của người nhằm xác định các đột biến trong ADN của người được xét nghiệm.

Ưu và nhược điểm của CES

Ưu điểm

CES ra đời nhằm đem lại những cập nhật tối ưu hơn so với WGS và WES trong chẩn đoán bệnh liên quan di truyền. Một số ưu điểm nổi bật bao gồm:

• Nhanh chóng và thuận tiện: phương pháp này tập trung vào một số vùng trên gen, do đó có thời gian thực hiện ngắn. Những vùng gen mục tiêu đều liên quan đến bệnh lí đã được nghiên cứu rõ ràng, từ đó CES giảm thiểu phát hiện quá nhiều biến thể chưa rõ ý nghĩa (Variant of Uncertain Significance – VUS). VUS thường không cần thiết trong chẩn đoán. Hơn nữa, giải trình tự exome lâm sàng có thể được thực hiện bằng các máy giải trình tự gen quy mô nhỏ và di động, nên không gian vận hành nhỏ hơn so với các hệ thống giải trình tự lớn.
• Chi phí thấp: quá trình giải trình tự được tiến hành trên một số vùng nhỏ trên bộ gen, dẫn đến giá thành thấp hơn so với các phương pháp phân tích phạm vi rộng như giải trình tự toàn bộ bộ gen WGS hay giải trình tự toàn bộ exome WES. Ngoài ra, CES ứng dụng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) để phân tích trình tự song song hàng loạt các đoạn ADN cùng lúc. Do đó, chi phí càng giảm đáng kể so với phương pháp giải trình tự từng gene đơn lẻ bằng kỹ thuật Sanger truyền thống.
• Tiếp cận không thiên vị: CES giải trình tự tất cả các gen cùng lúc thay vì chỉ phân tích các nhóm gen dựa trên triệu chứng cụ thể, nên CES có thể giảm thiểu sai sót do xác định kiểu hình bệnh không chính xác (do phổ biểu hiện của các bệnh di truyền thường rộng và khác nhau giữa mỗi bệnh nhân). Ngoài ra, quá trình sắp xếp và phân loại các gen ưu tiên dựa trên triệu chứng của bệnh nhân cũng có thể gặp sai số.

Nhược điểm

Tuy nhiên, CES vẫn tồn tại một số nhược điểm như:

• Các nhóm gen thường khác biệt nhau về cấu trúc, do đó, khi thực hiện CES, tất cả các gen không đảm bảo có thể được giải trình tự đồng đều. Một số trường hợp đột biến gen gây bệnh thuộc những vùng có phạm vi phân tích thấp và bị bỏ sót.
• Chưa có hệ thống giải thích kết quả chuẩn hóa chung cho tất cả các phòng thí nghiệm. Quá trình diễn giải kết quả phức tạp và khác biệt giữa những đơn vị xét nghiệm có thể dẫn đến sự không nhất quán cho bệnh nhân.
• Sau khi có kết quả CES, phác đồ điều trị chưa thể cung cấp ngay cho bệnh nhân. Tuy nhiên, bệnh nhân có thể làm tiếp các xét nghiệm chẩn đoán truyền thống.

Vai trò và ứng dụng

Chẩn đoán bệnh di truyền

CES đã mang lại một bước tiến vượt bậc trong chẩn đoán bất thường di truyền, đặc biệt các trường hợp hiếm gặp hoặc chưa được xác định rõ nguyên nhân. Những phương pháp xét nghiệm chẩn đoán truyền thống thường dựa và panel gen mục tiêu sẵn có, do đó các biến thể gây bệnh ngoài phạm vi có thể bị bỏ sót. Nhược điểm này được CES khắc phục bằng giải trình tự đồng thời các vùng mã hóa (exon) của hàng ngàn gen.

Ngoài ra, CES cung cấp thông tin cho xác nhận chẩn đoán lâm sàng, làm rõ cơ chế bệnh và định hướng các quyết định điều trị. Hơn nữa, CES còn có thể phát hiện thông tin di truyền mới, giải thích triệu chứng lâm sàng hoặc gợi ý hướng chẩn đoán cho một bệnh lí di truyền khác.

Sàng lọc trước sinh

CES cũng được ứng dụng trong sàng lọc trước sinh các bệnh di truyền. Từ tuần thứ 7 của thai kì, thai nhi bắt đầu phóng thích vào máu mẹ những đoạn ADN tự do được gọi là cfDNA. Mẫu ADN thai nhi được lấy từ máu thai phụ, tách chiết rồi phân tích exome bằng CES. Kết quả giúp bác sĩ có thể phát hiện sớm bất thường ngay từ trong bụng mẹ. Từ đó, hướng điều trị hoặc can thiệp sớm được chỉ định nhằm đảm bảo sức khỏe cho mẹ và thai nhi.

Nghiên cứu ung thư

Trong lĩnh vực ung thư, CES có thể xác định các đột biến soma cho mục đích nghiên cứu những hướng điều trị tiềm năng. Exome của mẫu khối u được so sánh với mẫu mô bình thường để phát hiện các đột biến gây ung thư chính và các dấu ấn sinh học. Từ đó, bác sĩ có thể đưa ra phác đồ điều trị ung thư phù hợp nhất cho từng bệnh nhân.

Tư vấn di truyền

CES cũng có vị trí đáng kể trong hoạt động tư vấn di truyền. Dựa trên CES, bác sĩ xác định nguyên nhân di truyền của một bệnh lí rồi sau đó đánh giá nguy cơ tái phát (tiên lượng bệnh di truyền) và đưa ra lời khuyên cho các thành viên trong gia đình. Bệnh nhân và gia đình có thể dựa vào thông tin từ bác sĩ để đưa ra các quyết định về phương pháp điều trị hoặc phòng ngừa cho tương lai, đặc biệt các bệnh di truyền gen lặn như thiếu máu tán huyết Thalassemia.

Nghiên cứu các bệnh di truyền

Ngoài chẩn đoán lâm sàng, CES là công cụ đáng tin cậy trong nghiên cứu di truyền. Kỹ thuật này cho phép các nhà khoa học nghiên cứu tác động chức năng của đột biến exome, tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình, phát hiện các gen liên quan đến bệnh mới. Dữ liệu từ CES mở rộng thư viện thông tin về cơ sở di truyền của các bệnh, từ đó mối liên hệ giữa gen và bệnh được tinh chỉnh nhằm tìm ra các mục tiêu điều trị mới.

Chỉ định và chống chỉ định

Chỉ định

Một số trường hợp có thể được chỉ định CES bao gồm:

• Người mắc rối loạn thần kinh chưa thể xác định được bệnh cụ thể do có các dấu hiệu và triệu chứng không rõ ràng hoặc không đồng nhất
• Người bệnh đã được thăm khám lâm sàng kỹ lưỡng và cung cấp đầy đủ thông tin về tiền sử bệnh của cá nhân và gia đình
• Các nguyên nhân khác có khả năng gây ra bệnh đã được loại trừ
• Các xét nghiệm di truyền như xét nghiệm đơn gen (single–gene test), xét nghiệm đa gene (multigene test) hoặc chromosomal microarray cho kết quả âm tính

Chống chỉ định

Một số trường hợp chống chỉ định CES nhằm tránh sai sót và lãng phí trong quá trình chẩn đoán như:

• Giải trình tự exome lâm sàng không nên được thực hiện đầu tiên để chẩn đoán một bệnh di truyền đang nghi ngờ
• Phương pháp này không nên được thực hiện khi chưa có đánh giá lâm sàng toàn diện bởi bác sĩ có trình độ chuyên môn về bệnh di truyền
• Giải trình tự exome lâm sàng không nên được tiến hành trong trường hợp bệnh nhân chưa được tư vấn di truyền kỹ lưỡng

Lời kết

Giải trình tự exome lâm sàng (CES) là công cụ hữu ích trong chẩn đoán và nghiên cứu các bệnh di truyền. Phương pháp này tiết kiệm thời gian và chi phí hơn so với phương pháp truyền thống. Từ đó, bệnh nhân có giải pháp cho những bệnh di truyền phức tạp và nguy hiểm. Tuy nhiên, người bệnh cần cân nhắc kỹ lưỡng kết hợp với tư vấn di truyền chuyên sâu và đánh giá lâm sàng toàn diện trước khi thực hiện nhằm đảm bảo hiệu quả và an toàn.