Nhuộm Gram
Cấu tạo vi khuẩn
Vi khuẩn là nhóm các sinh vật đơn bào phân bố rộng khắp nơi trên Trái Đất. Chúng hiện diện trên và trong cơ thể người bao gồm da, đường thở, miệng, hệ tiêu hóa, sinh sản và tiết niệu. Phần lớn các loại vi khuẩn cộng sinh trên cơ thể người đều không gây hại. Một số loại vi khuẩn hỗ trợ chức năng cơ thể như quá trình tiêu hóa và miễn dịch.
Vi khuẩn có hình dạng nhất định (cầu khuẩn, hình que, hình xoắn ốc), chúng thường hiện diện cùng nhau thành các tập hợp đặc trưng. Do đó, đặc điểm này thường được dùng để xác định và chẩn đoán loại vi khuẩn.
Vi khuẩn gram âm và gram dương đều có lớp peptidoglycan bên ngoài màng tế bào. Lớp này bảo vệ và tạo hình dạng cho vi khuẩn.
Nhuộm Gram
Nhuộm Gram là một trong những kỹ thuật kiểm nghiệm quan trọng nhất trong vi sinh học, phương pháp này được đặt theo tên của nhà nghiên cứu Hans Christian Gram—người đầu tiên phát triển kỹ thuật.
Khi nhuộm Gram, người ta sử dụng thuốc nhuộm crystal violet (purple dye) có màu tím và bổ sung iodine nhằm tạo tinh thể cố định lên thành peptidoglycan của tế bào. Sau đó, chất khử màu (thường là dung môi ethanol và aceton) được dùng để loại bỏ thuốc nhuộm dư thừa. Nguyên tắc cơ bản của kỹ thuật là khả năng giữ thuốc nhuộm (phụ thuộc vào độ dày peptidoglycan) của vi khuẩn.
Vi khuẩn gram dương
Vi khuẩn gram dương (gram-positive bacteria) là nhóm vi khuẩn cho kết quả dương tính khi nhuộm Gram. Chúng có lớp peptidoglycan dày (chiếm đến 90% thành tế bào), do đó, các phân tử thuốc nhuộm được lưu giữ lại và không bị rửa trôi. Khi quan sát dưới kính hiển vi sau khi nhuộm, vi khuẩn gram dương có màu xanh tím.
Các loài vi khuẩn gram dương bao gồm:
- Streptococcus pneumoniae: viêm phổi do vi khuẩn
- Tụ cầu vàng: viêm phổi do vi khuẩn, tụ cầu vàng kháng Methicillin (MRSA) và hội chứng sốc nhiễm độc
- Các loài Streptococcus nhóm A: viêm họng liên cầu khuẩn
- Listeria: ngộ độc thực phẩm
- Clostridium: ngộ độc thực phẩm
- Clostridium botulinum và clostridium butyricum: ngộ độc thịt
Vi khuẩn gram âm
Vi khuẩn gram âm (gram-negative bacteria) là nhóm vi khuẩn cho kết quả âm tính khi nhuộm Gram. Lớp peptidoglycan của nhóm này rất mỏng (khoảng 10% thành tế bào) khiến thuốc nhuộm dễ bị rửa trôi bằng dung dịch cồn hoặc aceton. Khi quan sát dưới kính hiển vi, nhóm này thường có màu hồng.
Những loại vi khuẩn gram âm phổ biến như sau:
- Escherichia coli: nhiễm trùng đường tiết niệu (UTI) và ngộ độc thực phẩm
- Legionella pneumoniae: bệnh Legionnaires
- Salmonella: ngộ độc thực phẩm và sốt thương hàn
- Klebsiella: viêm phổi, nhiễm trùng máu, nhiễm trùng vết thương hoặc vết phẫu thuật và viêm màng não do vi khuẩn
- Neisseria gonorrhoea: bệnh lậu
- Proteus: nhiễm trùng đường tiết niệu
- Morganella morganii: các bệnh nhiễm trùng như nhiễm trùng tiểu, huyết, vết thương, hệ thần kinh trung ương hoặc cơ xương, viêm phổi và viêm màng ngoài tim
- Aeromonas: nhiễm trùng mắt, viêm tủy xương , viêm màng não do vi khuẩn, nhiễm trùng đường hô hấp sau cận đuối nước* và nhiễm trùng khớp
(*): Nhiễm trùng đường hô hấp sau cận đuối nước (near drowning) là tình trạng bệnh nhân viêm phổi do sặc hoặc hít phải nước sông, suối, ao hồ sau một tai nạn suýt chết đuối.
Vi khuẩn gram âm là vấn đề sức khỏe nghiêm trọng do khả năng kháng kháng sinh cao. Bệnh nhân nhiễm phải những chủng loại này cần chăm sóc đặc biệt, nguy cơ tiến triển bệnh và tử vong cao.
Vai trò của nhuộm Gram
Bác sĩ cần nhận định vi khuẩn là gram âm hay gram dương để có phác đồ điều trị hiệu quả. Cụ thể hơn, vi khuẩn gram âm có khả năng kháng kháng sinh cao hơn do chúng có thể tạo ra các gen và cơ chế chuyên biệt nhằm làm giảm hiệu quả của chất diệt khuẩn. Những cơ chế có thể bao gồm chủ động bơm thuốc kháng sinh ra khỏi tế bào, thay đổi tính thấm của màng và biến đổi thụ thể chuyên biệt với chất diệt khuẩn.
Ngoài ra, vi khuẩn gram âm có khả năng gây bệnh rất cao trên người, chúng xâm nhập phần lớn các hệ thống trong cơ thể như hệ tiêu hóa, hệ thần kinh, hệ tiết niệu và máu. Từ đó, chúng gây viêm dạ dày ruột, tiêu chảy và viêm màng não nghiêm trọng.
Một trong những có khăn lớn nhất của y bác sĩ là điều trị nhiễm trùng bệnh viện** đường hô hấp dưới liên quan đến vi khuẩn gram âm. Những chủng vi sinh vật bệnh viện này có tỉ lệ kháng thuốc cao và khả năng thẩm thấu thuốc vào nhu mô phổi kém.
(**): Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), nhiễm khuẩn do chăm sóc y tế (Healthcare–associated Infections— HAIs) còn gọi là nhiễm trùng bệnh viện (nosocomial infection) do bệnh nhân phơi nhiễm khi đến khám chữa bệnh tại các cơ sở y tế, đặc biệt khi trải qua điều trị và thủ thuật xâm lấn.
Nhuộm Gram và nuôi cấy vi khuẩn
Nhuộm Gram là phương pháp giúp nhận diện sơ bộ mẫu bệnh phẩm có sự hiện diện của vi khuẩn hay không. Trường hợp mẫu nhiễm trùng, vi khuẩn gram âm hoặc dương cũng được bác sĩ xác định để có đánh giá nhanh và đưa ra các quyết định tiếp theo.
Đối với nuôi cấy vi khuẩn, mẫu bệnh phẩm dùng nhuộm Gram ban đầu được bổ sung vào môi trường dinh dưỡng và điều kiện thích hợp cho vi khuẩn phát triển. Mục đích chính của phương pháp là làm tăng sinh các chủng vi sinh vật có trong mẫu để tiến hành đánh giá. Kết quả thường có sau vài ngày hoặc lâu hơn (tùy thuộc vào tốc độ tăng trưởng của vi khuẩn). Nuôi cấy vi khuẩn hỗ trợ bác sĩ định danh chính xác chủng loại vi khuẩn nhiễm trong mẫu.
Quy trình thực hiện
Đầu tiên, bác sĩ tiến hành thu nhận mẫu xét nghiệm. Mẫu có thể là dịch (dịch não tủy, dịch khớp hoặc dịch màng phổi), đờm, nước tiểu, phân. Sau đó, chúng được chuyển đến phòng thí nghiệm để nhuộm.
Nhuộm Gram có 4 bước cơ bản:
- Bước 1: bổ sung chất nhuộm crystal violet (purple dye) vào tiêu bản mẫu
- Bước 2: thêm iodine để cố định các phân tử màu lên màng peptidoglycan
- Bước 3: rửa mẫu sau nhuộm bằng ethanol, acetone hoặc hỗn hợp cả hai
- Bước 4: thêm safranin nhằm làm nổi bật màu vi khuẩn gram âm
Sau khi xử lý kỹ thuật, bác sĩ quan sát mẫu rồi đánh giá dựa trên màu sắc và hình dạng của vi khuẩn dưới kính hiển vi:
- Màu sắc: phần lớn vi khuẩn gram dương có màu xanh đến tím, gram âm có màu hồng đến đỏ
- Hình dạng: các hình dạng phổ biến như hình cầu, hình que, dạng xoắn
Yếu tố ảnh hưởng kết quả
Quy trình thu mẫu bệnh phẩm không đúng cách hoặc dụng cụ thu mẫu không vô trùng dẫn đến nhiễm những vi sinh vật lạ gây nhiễu kết quả xét nghiệm. Các tiêu bản mẫu dày và vón cục có thể làm khó quan sát dưới kính hiển vi.
Thời gian giải nhuộm cần theo dõi chặt chẽ nhằm tránh hiện tượng mất màu quá mức hoặc dưới ngưỡng phân biệt rõ giữa các màu gây ra sai lệch kết quả. Các tiêu bản cần được đánh giá khi vẫn còn tươi. Mẫu lâu ngày khiến lớp peptidoglycan mất dần theo thời gian dẫn đến vi khuẩn gram dương trở thành gram âm.
Những yếu tố khiến nhuộm Gram không thể phát hiện vi sinh vật bao gồm:
- Bệnh nhân sử dụng kháng sinh trước khi lấy mẫu
- Vết phết mẫu trên lam kính quá dày
- Nồng độ crystal violet thấp
- Cố định với iodine không đủ
- Rửa mẫu hoặc giải nhuộm quá mức
- Kinh nghiệm và tay nghề của kỹ thuật viên chưa đảm bảo
Kết luận
Nhuộm Gram là xét nghiệm chẩn đoán ban đầu để đánh giá tình trạng nhiễm trùng. Phương pháp này cho kết quả nhanh hơn so với nuôi cấy vi khuẩn. Tuy nhiên, trong phần lớn các trường hợp, nhuộm Gram không thể định danh chính xác loại vi khuẩn, do đó nuôi cấy vi khuẩn hoặc các xét nghiệm di truyền có thể được chỉ định. Nhuộm Gram có thể giúp bác sĩ đưa ra phác đồ điều trị thích hợp cho từng bệnh nhân.
References
- Cleveland Clinic. Gram Stain. Retrieved December 05, 2023 from https://my.clevelandclinic.org/health/diagnostics/22612-gram-stain
- National Library of Medicine. Gram Staining. Retrieved December 05, 2023 from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK562156/
- National Library of Medicine. Gram-Positive Bacteria. Retrieved December 05, 2023 from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK470553/
- Cleveland Clinic. Bacteria. Retrieved December 05, 2023 from https://my.clevelandclinic.org/health/articles/24494-bacteria
- National Library of Medicine. Gram-Negative Bacteria. Retrieved December 05, 2023 from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK538213/
- National Library of Medicine. Medical Microbiology. Retrieved December 05, 2023 from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK8477/
- Molecular Expressions. Bacteria Cell Structure. Retrieved December 05, 2023 from https://micro.magnet.fsu.edu/cells/bacteriacell.html