Công nghệ giải trình tự đoạn dài (Long-read sequencing)

Giải mã và hiểu bộ gen là nền tảng quan trọng giúp con người nghiên cứu các cơ chế bệnh lý, từ đó phát triển phương pháp chẩn đoán sớm và thiết kế liệu pháp điều trị hiệu quả cho nhiều bệnh di truyền. Người ta bắt đầu quan tâm đến giải mã ADN từ cuối thế kỷ 19 với những khám phá nền tảng về acid nucleic. Đến năm 1977, phương pháp Sanger ra đời, tạo bước ngoặt khi cho phép đọc các đoạn ADN dài vài trăm base. Tuy nhiên, phương pháp Sanger có tốc độ chậm, chi phí cao và khả năng xử lý hạn chế, khiến quá trình giải mã toàn bộ bộ gen trở nên khó khăn và tốn kém.

Nhằm khắc phục những hạn chế này, công nghệ giải trình tự thế hệ thứ hai (Next Generation Sequencing – NGS) xuất hiện vào những năm 2000, tạo bước đột phá với khả năng đọc hàng triệu đoạn ADN ngắn cùng lúc. NGS giúp giảm mạnh chi phí và thời gian giải trình tự, đưa quá trình phân tích gen trở nên phổ biến hơn trong nghiên cứu và ứng dụng lâm sàng. Tuy vậy, NGS vẫn chủ yếu dựa trên các đoạn đọc ngắn (thường 50-300 base), dẫn đến khó khăn khi ghép nối các vùng gen lặp lại, phức tạp hoặc xác định các biến đổi cấu trúc lớn trong bộ gen.

Chính những hạn chế này đã thúc đẩy sự phát triển của công nghệ giải trình tự đoạn dài (long-read sequencing), phương pháp mới có thể đọc được các đoạn ADN dài hàng chục ngàn đến hàng triệu base trong một lần chạy, từ đó mở ra cơ hội tiếp cận toàn diện hơn với các vùng gen phức tạp.

Long-read sequencing là gì?

Long-read sequencing là kĩ thuật giải trình tự ADN hoặc ARN có thể đọc các đoạn phân tử dài, thường từ 1.000 đến hàng trăm ngàn base liên tiếp. Khác với short-read sequencing chỉ đọc được các đoạn ngắn, long-read sequencing có thể giải mã trực tiếp các phân tử ADN/ARN tự nhiên với độ dài lớn, không cần cắt nhỏ quá mức.

Do đó, các nhà khoa học dễ dàng phát hiện các biến đổi cấu trúc lớn, các vùng lặp lại, các quá trình ghép nối gen phức tạp hoặc các trình tự khó đọc mà trước đây gần như không thể phát hiện được với các phương pháp truyền thống.

Các công nghệ đọc trình tự đoạn dài phổ biến

SMRT

Công nghệ SMRT (Single Molecule Real-Time) là một trong những đột phá lớn của thế hệ giải trình tự thứ ba, do hãng Pacific Biosciences phát triển. Công nghệ SMRT hoạt động bằng cách theo dõi trực tiếp quá trình tạo ra một sợi ADN mới dựa trên sợi ADN gốc. Đáng chú ý, công nghệ này có thể cho phép quan sát từng phân tử ADN riêng lẻ khi quá trình tổng hợp ADN diễn ra trong thời gian thực. Quan trọng hơn, phương pháp này không cần phải tạo ra nhiều bản sao của ADN ban đầu trước khi đọc, từ đó giúp giữ nguyên các đặc điểm tự nhiên của phân tử ADN.

Công nghệ giải trình tự SMRT bắt đầu bằng quá trình tạo thư viện ADN chuyên biệt mang tên SMRTbell. Phân tử SMRTbell gồm ADN mạch đôi liên kết với hai adapter hình kẹp tóc tại hai đầu, hình thành cấu trúc vòng khép kín. Thư viện này được đưa vào chip SMRT Cell có chứa hàng triệu giếng siêu nhỏ gọi là Zero-Mode Waveguide (ZMW). Mỗi giếng ZMW có kích thước chính xác để chứa một phân tử ADN và một enzyme polymerase cố định tại đáy.

Khi quá trình giải trình tự khởi động, các nucleotide mang nhãn huỳnh quang đặc trưng (A, T, G, C) được thêm vào hỗn hợp phản ứng. Enzyme polymerase tiến hành tổng hợp chuỗi ADN mới dựa trên khuôn mẫu. Khi mỗi nucleotide được gắn vào chuỗi, tín hiệu huỳnh quang đặc trưng được tạo ra. Nhờ thiết kế của giếng ZMW, duy nhất tín hiệu phát từ đáy giếng được ghi nhận, từ đó giúp loại nhiễu nền và tăng độ nhạy. Hệ thống camera tốc độ cao liên tục ghi lại các tín hiệu này và xác định chuẩn xác trình tự nucleotide trong phân tử ADN.

Ưu thế của SMRT là khả năng đọc đoạn ADN siêu dài, trung bình từ 8.000 đến 15.000 base, và có thể đạt 40.000-70.000 base trong điều kiện tối ưu. Đáng chú ý, với phương thức Circular Consensus Sequencing (CCS), hệ thống tận dụng cấu trúc vòng của SMRTbell để polymerase đi nhiều vòng quanh cùng một phân tử ADN. Quá trình này tạo ra nhiều lượt đọc từ cùng một phân tử, sau đó được tổng hợp thành một đoạn đọc cuối cùng. Bằng cách so sánh và kết hợp dữ liệu từ nhiều lượt đọc, CCS hiệu quả loại bỏ sai số ngẫu nhiên với độ chính xác đạt 99,9%, thậm chí 99,999%.

Ngoài ra, SMRT còn có khả năng phát hiện trực tiếp các biến đổi biểu sinh như methyl hóa ADN mà không cần xử lý hóa học phức tạp. Công nghệ này cũng ít bị ảnh hưởng bởi thành phần GC hoặc các vùng lặp lại, giúp giải mã hiệu quả các vùng gen khó tiếp cận. Với các ưu điểm trên, SMRT trở thành lựa chọn lý tưởng cho nhiều ứng dụng: từ lắp ráp bộ gen phát hiện biến đổi cấu trúc quy mô lớn đến phát hiện biến thể hiếm và nghiên cứu biểu sinh.

Nanopore

Công nghệ giải trình tự Nanopore, do Oxford Nanopore Technologies phát triển, mang đến một cách tiếp cận hoàn toàn khác biệt so với các phương pháp truyền thống. Thay vì dựa trên tổng hợp ADN và ghi nhận tín hiệu huỳnh quang, Nanopore tận dụng các lỗ nano sinh học hoặc tổng hợp (nanopore) gắn trên màng mỏng, kết hợp với dòng điện ion nhằm đọc trực tiếp trình tự ADN hoặc ARN. Các phân tử ADN/ARN cần giải trình tự được gắn thêm các đoạn ADN ngắn chuyên biệt được gọi là adapter và một loại protein có vai trò kiểm soát tốc độ di chuyển, gọi là motor protein. Sau đó, thư viện ADN hoặc ARN đã chuẩn bị này được đưa vào một con chip đặc biệt gọi là flow cell. Flow cell này chứa hàng ngàn lỗ siêu nhỏ được gắn trên một màng mỏng. Máy tạo ra một điện thế kéo các phân tử ADN/ARN đi qua các lỗ nanopore. Protein kiểm soát tốc độ (motor protein) gắn trên phân tử điều chỉnh tốc độ di chuyển của phân tử qua lỗ, từ đó đảm bảo quá trình này diễn ra đủ chậm để hệ thống có thể ghi nhận chính xác thông tin khi từng phần của phân tử đi qua lỗ.

Khi ADN hoặc ARN đi qua nanopore, mỗi base (A, T, C, G) hoặc tổ hợp base làm thay đổi dòng điện ion chảy qua lỗ theo một kiểu đặc trưng. Máy liên tục đo các biến thiên dòng điện này với độ phân giải rất cao. Dữ liệu dòng điện thô sau đó được các thuật toán học máy phân tích và chuyển đổi thành trình tự các base. Đáng chú ý, vì tín hiệu dòng điện còn chịu ảnh hưởng của các biến đổi hóa học trên base (ví dụ methyl hóa), Nanopore có thể phát hiện trực tiếp các biến đổi biểu sinh mà không cần xử lý.

Một ưu điểm nổi bật của Nanopore là không giới hạn độ dài đọc – chiều dài đoạn đọc chỉ phụ thuộc vào độ nguyên vẹn của phân tử ADN/ARN đầu vào. Trong thực tế, các đoạn đọc dài hàng trăm ngàn base, thậm chí trên 2 triệu base đã được ghi nhận, giúp giải mã trọn vẹn các vùng lặp lại, cấu trúc phức tạp hoặc thậm chí toàn bộ nhiễm sắc thể trong một lần chạy. Công nghệ này cũng cho phép giải mã trực tiếp ARN, phát hiện các quá trình ghép nối phức tạp mà các phương pháp khác khó tiếp cận.

Nanopore cũng có khả năng bao phủ gần như toàn bộ bộ gen, kể cả các vùng phương pháp short-read không thể tiếp cận, nhờ chiều dài đọc vượt trội và không bị lệ thuộc vào thành phần GC hoặc cấu trúc lặp lại. Ngoài ra, do không cần khuếch đại PCR, công nghệ này giảm thiểu sai lệch và bảo toàn các đặc điểm biểu sinh tự nhiên của phân tử gốc.

Với khả năng đọc siêu dài, giải mã trực tiếp ADN/ARN, phát hiện biến đổi biểu sinh, tốc độ trả kết quả nhanh và thiết bị linh hoạt, Nanopore đang trở thành lựa chọn hàng đầu cho các ứng dụng từ nghiên cứu cơ bản, lắp ráp bộ gen phức tạp, phân tích transcriptome, đến chẩn đoán lâm sàng, giám sát dịch bệnh ngoài hiện trường.

Ứng dụng nổi bật của long-read sequencing

Tạo bản đồ gen hoàn chỉnh

Công nghệ đọc trình tự dài cho phép các nhà khoa học đọc được các đoạn ADN dài liên tục. Trước đây, công nghệ cho phép đọc được đoạn ngắn khoảng 100-300 nucleotide và phải ghép nhiều đoạn ngắn lại với nhau, do đó thường tạo ra sai sót và khoảng trống. Công nghệ mới có thể đọc được đoạn dài tới 40.000–70.000 Nu. Khi lắp ráp bộ gen mới, các đoạn đọc dài này giúp các nhà nghiên cứu thấy được trình tự liên tục, từ đó tạo ra bản đồ gen hoàn chỉnh và chính xác hơn.

Phát hiện thay đổi lớn trong cấu trúc gen

Công nghệ đọc trình tự dài phát hiện được các thay đổi lớn trong cấu trúc gen như: thêm đoạn ADN, mất đoạn ADN, đảo ngược vị trí hoặc lặp lại nhiều lần. Các thay đổi này thường gây ra nhiều bệnh nhưng khó phát hiện bằng công nghệ đọc ngắn. Khi nghiên cứu ung thư, các nhà khoa học cần biết chính xác những thay đổi này để hiểu nguyên nhân và tìm cách điều trị. Công nghệ đọc dài giúp phát hiện chính xác vị trí, kích thước và loại biến đổi cấu trúc trong bộ gen.

Phát hiện biến đổi hóa học trên ADN

Ngoài trình tự các chữ cái ADN (A, T, G, C), còn có các biến đổi hóa học trên ADN như gắn thêm nhóm methyl. Những biến đổi này quyết định gen nào hoạt động và gen nào không hoạt động trong tế bào. Công nghệ đọc dài có thể phát hiện trực tiếp các nhóm methyl khi đọc trình tự ADN, không cần qua bước xử lý hóa học phức tạp. Do đó, các nhà nghiên cứu có thể hiểu rõ hơn về cách điều khiển hoạt động của gen và các bệnh liên quan.

Phân tích chuỗi ARN đầy đủ

Gen trong ADN sẽ được sao chép thành ARN để hướng dẫn tế bào sản xuất protein. Một gen có thể tạo ra nhiều loại ARN khác nhau qua quá trình cắt ghép. Công nghệ đọc dài giúp phân tích toàn bộ chuỗi ARN từ đầu đến cuối, xác định chính xác các dạng ARN khác nhau được tạo ra từ cùng một gen. Thông tin này giúp hiểu rõ hơn về chức năng và cách điều hòa hoạt động của gen trong tế bào.

Ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị bệnh

Công nghệ đọc trình tự dài đang được sử dụng trong y học nhằm:

• Chẩn đoán các bệnh di truyền hiếm gặp bằng cách phát hiện các biến đổi gen đặc trưng
• Xác định các biến đổi gen gây bệnh mà công nghệ trước đây không thấy được
• Phát hiện các loại vi khuẩn, virus khó nuôi cấy trong phòng thí nghiệm
• Theo dõi dịch bệnh bằng các thiết bị nhỏ gọn có thể mang đến vùng dịch

Những tiến bộ này giúp bác sĩ có thêm thông tin để đưa ra phương pháp điều trị phù hợp cho từng bệnh nhân.

Ưu điểm

Đọc được các đoạn ADN/ARN rất dài

Đây là ưu điểm nổi bật nhất, cho phép các nhà khoa học quan sát được những vùng trình tự kéo dài liên tục. Điều này cực kỳ quan trọng trong lắp ráp toàn bộ bộ gen từ đầu (de novo assembly) một cách chính xác, không bị gián đoạn bởi các vùng lặp lại phức tạp. Khả năng này cũng giúp phát hiện rõ ràng các biến đổi cấu trúc lớn trong bộ gen, chẳng hạn như các đoạn ADN bị thêm vào, mất đi, đảo ngược vị trí hoặc lặp lại nhiều lần. Đây là những loại biến đổi thường liên quan đến nhiều bệnh lý phức tạp như ung thư hay bệnh di truyền.

Giải mã trực tiếp phân tử tự nhiên

Không giống như nhiều phương pháp giải trình tự thế hệ cũ yêu cầu nhân bản (khuếch đại) ADN bằng kỹ thuật PCR trước khi đọc, long-read sequencing có thể đọc trực tiếp phân tử ADN hoặc ARN gốc. Do đó, sai sót ngẫu nhiên có thể phát sinh trong quá trình PCR được giảm thiểu, đồng thời các dấu hiệu hóa học tự nhiên trên ADN (biến đổi biểu sinh) cũng được bảo toàn.

Phát hiện biến đổi biểu sinh và isoform ARN

Một số công nghệ long-read, đặc biệt là Nanopore, có khả năng phát hiện trực tiếp các biến đổi hóa học trên các base ADN, chẳng hạn như sự methyl hóa. Đây là những dấu hiệu quan trọng trong nghiên cứu biểu sinh, giúp hiểu cơ chế điều hòa hoạt động của gen. Đối với ARN, khả năng đọc toàn bộ chiều dài phân tử cho phép xác định chính xác các biến thể ghép nối (splicing) và các dạng isoform ARN khác nhau được tạo ra từ cùng một gen, điều mà các đọc trình tự đoạn ngắn rất khó thực hiện.

Thiết bị nhỏ gọn

Đối với công nghệ Nanopore, các thiết bị giải trình tự có kích thước rất nhỏ gọn (ví dụ như MinION chỉ bằng chiếc USB), có thể kết nối với laptop và hoạt động ngoài phòng thí nghiệm. Điều này mở ra khả năng ứng dụng to lớn trong các tình huống cần kết quả nhanh tại chỗ như giám sát dịch bệnh tại vùng bùng phát, phân tích mẫu môi trường hoặc kiểm tra chất lượng thực phẩm ngay tại hiện trường.

Hạn chế

Độ chính xác từng base thấp hơn so với short-read sequencing

Mặc dù đã có những cải tiến đáng kể, độ chính xác khi đọc từng base riêng lẻ của long-read sequencing thường thấp hơn so với short-read sequencing. Các lỗi phổ biến thường là thêm hoặc bớt (insertion/deletion) các base. Tuy nhiên, vấn đề này đang được khắc phục bằng cách đọc lặp lại cùng một phân tử nhiều lần hoặc sử dụng các thuật toán hiệu chỉnh lỗi phức tạp.

Chi phí trên mỗi base cao

So với công nghệ NGS đã rất phổ biến, chi phí để giải trình tự một lượng ADN nhất định (tính trên mỗi base) bằng long-read sequencing vẫn còn cao hơn. Thông lượng dữ liệu tạo ra trong một lần chạy máy cũng thường thấp hơn so với các hệ thống NGS quy mô lớn. Tuy nhiên, sự cạnh tranh giữa các hãng và những cải tiến công nghệ đang giúp giảm dần chi phí và tăng thông lượng, làm cho long-read sequencing ngày càng dễ tiếp cận hơn.

Yêu cầu mẫu ADN/ARN chất lượng cao

Để có được các đoạn đọc dài thực sự, mẫu ADN hoặc ARN ban đầu cần phải có chất lượng cao, tức là các phân tử phải còn nguyên vẹn và không bị đứt gãy quá nhiều. Yêu cầu này có thể gây khó khăn đối với một số loại mẫu sinh học hoặc khi lượng mẫu ban đầu rất ít.

Qui trình và phân tích tin sinh học phức tạp

Dữ liệu từ long-read sequencing có đặc điểm khác biệt so với dữ liệu short-read. Do đó, các bước xử lý và phân tích dữ liệu thường yêu cầu các thuật toán và phần mềm chuyên dụng phức tạp hơn. Do đó, người thực hiện phân tích cần phải có kiến thức và kinh nghiệm nhất định về tin sinh học.

Lời kết

Công nghệ giải trình tự đoạn dài (long-read sequencing) đánh dấu một bước tiến quan trọng trong lĩnh vực giải mã bộ gen, vượt qua nhiều hạn chế của các phương pháp truyền thống. Với khả năng đọc các đoạn ADN/ARN dài, phát hiện biến đổi cấu trúc phức tạp và nghiên cứu biểu sinh trực tiếp, long-read sequencing mở ra những cơ hội mới cho nghiên cứu khoa học cơ bản và ứng dụng lâm sàng. Mặc dù vẫn còn những thách thức về độ chính xác, chi phí và phân tích dữ liệu, sự phát triển không ngừng của công nghệ này hứa hẹn tiếp tục cách mạng hóa hiểu biết của con người về sự sống và đóng góp vào sự tiến bộ của y học cá thể hóa trong tương lai.