Giải trình tự exome (Whole exome sequencing – WES)
Giải trình tự exome (Whole Exome Sequencing – WES) là một kĩ thuật đọc trình tự toàn bộ vùng mã hóa protein của các gen trong hệ gen, nó là một trong những phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới (NGS). WES được mô tả lần đầu tiên vào năm 2009 với nhiều sự quan tâm. Thông thường, chỉ 1,5% bộ gen người có chức năng điều hòa cũng như tham gia mã hóa protein, khoảng 85% các đột biến gây bệnh xuất hiện trong vùng này. Phương pháp giải trình tự toàn bộ exome giúp tối đa hóa lượng dữ liệu liên quan đến lâm sàng đồng thời tạo ra ít dữ liệu đáng kể hơn so với kĩ thuật giải trình tự toàn bộ gen (WGS).
Exome là gì?
Exome là tập hợp tất cả các trình tự trong bộ gen có khả năng mã hóa tạo ra exon. Trong quá trình biểu hiện thông tin di truyền từ ADN sang protein, các đoạn gen trên ADN thực hiện phiên mã tạo nên trình tự ARN thông tin mới chưa trưởng thành (còn gọi là pre-mRNA). Trình tự này chứa cả 2 vùng intron và exon nằm xen kẽ với nhau. Sau đó, các phức hợp trong nhân tham gia biến đổi pre-mRNA này bằng cách cắt bỏ những đoạn intron không có chức năng mã hóa và sắp xếp lại các đoạn exon. Quá trình ghép nối này tạo nên một cấu trúc ARN trưởng thành chứa toàn bộ vùng exon có chức năng dịch mã tạo thành protein. Như vậy, exome là một phần rất nhỏ trong toàn bộ trình tự bộ gen, chúng chứa phần lớn thông tin di truyền tạo nên protein.
Ảnh: Truyền đạt thông tin di truyền trong cơ thể
Nguồn: Cincinnati Children’s
Qui trình thực hiện
Kĩ thuật WES được thực hiện bằng công nghệ NGS đọc ngắn. Cụ thể hơn, bộ gen của bệnh nhân được phân mảmh và chỉ những trình tự ADN đại diện cho vùng mã hóa protein được làm giàu. Dữ liệu giải trình tự chỉ tạo ra cho các vùng mã hóa này và một lượng nhỏ ADN không mã hóa liền kề. Sau khi giải trình tự, thông tin sẽ giới hạn trong một tập hợp con các gen liên quan đến đặc điểm di truyền của bệnh nhân.
Qui trình giải trình tự exome như sau:
1.Phân mảnh ADN
Phần lớn các thí nghiệm thực hiện phân mảnh ADN như bước đầu tiên trong giải trình tự. Kích thước các đoạn ADN phân mảnh tùy thuộc vào mục tiêu thí nghiệm và phương pháp thực hiện. Một số phương pháp chính dùng trong phân cắt mẫu ADN bao gồm:
- Phương pháp vật lý: Người ta có thể sử dụng nhiều yếu tố vật lí nhằm cắt mẫu ADN bao gồm âm thanh, siêu âm và thủy động lực. Trong số đó, cắt âm và siêu âm là phương pháp chính.
- Phương pháp enzyme: Các enzyme có thể cắt ADN thành các mảnh nhỏ bao gồm nuclease hoặc transposease. Trong đó, nuclease cắt liên kết phosphodiester giữa các nucleotide khiến cho hai nucleotide liền kề tách ra. Transposease thường được dùng trong điều hòa quá trình chuyển vị ADN từ vị trí này sang vị trí khác, do đó nó cũng có thể phân cắt ADN thành các đoạn nhỏ nhưng không chèn lại vào vị trí mới.
2.Phân lập exome hay làm giàu ADN mục tiêu
Làm giàu trình tự ADN mục tiêu là bước chuẩn bị trước khi giải trình tự, trong đó các chuỗi ADN được khuếch đại trực tiếp bằng PCR hoặc được thu thập bằng hybrid capture. Exome chỉ chiếm khoảng 1,5% trong bộ gen, do đó người ta chỉ tập trung làm giàu vùng trình tự này nhằm cung cấp nguồn nguyên liệu đầu vào cho quá trình giải trình tự. Thiết kế đầu dò khi phân lập exome là một bước cực kì quan trọng trong kĩ thuật WES. Do đó, một số chi tiết cần được xem xét trước khi thiết kế các đầu dò nhắm mục tiêu exon bao gồm vùng giàu GC, chất lượng đoạn ADN, kích thước phần chèn và các lặp lại trong trình tự.
Kit | Vùng mục tiêu | Kích thước ADN đầu vào | Chiều dài đầu dò (mer) |
---|---|---|---|
Agilent SureSelect XT2 V6 Exome | 60 Mb | 100 ng | 120 |
Agilent SureSelect XT2 V5 Exome | 51 Mb | 100 ng | 120 |
IDT xGEN Exome Panel | 39 Mb | 500 ng | Không được mô tả |
Illumina Nextera Rapid Capture Expanded Exometd> | 62 Mb | 50 ng | 95 |
Roche NimblegenSeqCap EZ Exome v3.0 | 64 MB | 1 ng | 60–90 |
Bảng-1: Những kit phổ biến dung trong phân lập exome.
3.Thu nhận sản phẩm
Sau khi tách exome và các phần khác của bộ gen, người ta cần phải rửa và rửa giải nhiều lần nhằm loại bỏ những thành phần không mong muốn như trình tự khác ngoài exome, protein và chất điện giải. Nước cất thường được dùng trong quá trình rửa, dung dịch li giải đặc biệt như eluent được sử dụng cho quá trình rửa giải. Eluent là dung dịch li giải giúp rửa sạch exome khỏi microarray hoặc hạt từ tính, từ đó chúng phá vỡ kết nối giữa exome và các chất liên kết.
4.Giải trình tự
Do yêu cầu về thời gian và độ dài của giải trình tự Sanger, công nghệ giải trình tự không đóng góp nhiều trong các nghiên cứu sinh học và lâm sàng cho đến khi các công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) được phát minh. Công nghệ NGS sử dụng ddNTP nhuộm trong phương pháp Sanger và một số cải tiến khác cho phép các chuỗi ADN kết hợp, khuếch đại và phát hiện cùng một lúc, từ đó hiệu quả giải trình tự và dữ liệu đọc tăng lên nhanh chóng. Dữ liệu giải trình tự được tích hợp bằng thuật toán tin sinh học cho phép phân tích được dữ liệu lớn và phát hiện thông lượng cao.
5.Phân tích dữ liệu
Phần lớn các phương pháp giải trình tự tạo ra các đoạn trình tự ngắn nên dữ liệu rất khó hiểu và không thể đọc. Do đó, kĩ thuật viên cần phần mềm phân tích dữ liệu trình tự thu được theo mục tiêu nghiên cứu.
Ưu, nhược điểm của WES
Ưu điểm
Một trong những ưu điểm chính của WES là tiết kiệm chi phí khi thực hiện giải trình tự với một lượng mẫu lớn. Kĩ thuật này chỉ giải trình tự exome nên lượng dữ liệu tạo ra ít hơn đáng kể so với kĩ thuật WGS, do đó chi phí phân tích thấp hơn.
Exome chứa phần lớn các đột biến gây bệnh đã biết nên nó là một công cụ hiệu quả để xác định biến thể di truyền liên quan đến bệnh. Exome có thể được ứng dụng trong nghiên cứu ung thư bằng cách xác định các đột biến liên quan đến quá trình hình thành và phát triển khối u. Nghiên cứu cho thấy WES có thể là một công cụ hữu ích trong nâng cao chẩn đoán lâm sàng. Ví dụ, Retter và cộng sự đã phân tích một loạt 3040 trường hợp WES lâm sàng vào năm 2016, họ phát hiện WES có hiệu suất chẩn đoán tổng thể khoảng 28,8%.
Ngoài ra, WES còn có một số ưu điểm khác bao gồm:
- Phát hiện các đột biến đơn, đột biến thêm hoặc mất đoạn ngắn với độ chính xác cao
- Tạo ra ít biến thể chưa rõ chức năng (Variant of Uncertain Significance – VUS) hơn WGS
- Sử dụng trong xác định các nguyên nhân di truyền mới gây bệnh
- Tạo ra một trình tự nhỏ hơn nên dễ quản lý
Nhược điểm
Tuy nhiên, một trong những nhược điểm lớn của WES là có thể bỏ sót các đột biến quan trọng nằm ngoài exome. Một số vùng gen có thể tham gia điều hòa biểu hiện của các gen khác. Ngoài ra, WES cũng không thể xác định các đột biến cấu trúc hoặc các đột biến thêm, mất đoạn gen lớn.
Ngoài ra, WES còn có một số nhược điểm bao gồm:
- Cần kết hợp sử dụng thêm panel khi chẩn đoán các bệnh di truyền hiếm gặp. Mặc dù dữ liệu giải trình tự tạo ra tất cả các gen, chỉ những gen được biết là có liên quan đến bệnh di truyền trên bệnh nhân được phân tích.
- Đặt ra thách thức về vấn đề giải thích lâm sàng số lượng lớn các biến thể đã xác định.
- Nguy cơ phát hiện ngẫu nhiên cao hơn so với thử nghiệm có mục tiêu.
- Khó phát hiện thể khảm do độ sâu giải trình tự (số lần một nucleotide nhất định trong bộ gene được đọc trong khi giải trình tự) còn hạn chế.
- Không phát hiện các biến thể liên quan đến số lượng nhiễm sắc thể (Copy Number Variants – CNVs) cũng như bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể.
Lời kết
Giải trình tự toàn bộ exome (Whole Exome Sequencing – WES) là một kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới cho phép giải trình tự tất cả các vùng mã hóa protein có trong bộ gen. WES sử dụng các đầu dò nhằm trích xuất các trình tự mã hóa protein và loại bỏ hiệu quả đến 99% bộ gen còn lại, từ đó cung cấp thông tin chi tiết nhất về những thay đổi trong exome. Người ta sử dụng dữ liệu giải trình tự cho nhiều mục đích khác nhau như xác định đột biến mã hóa trong bệnh ung thư hay sàng lọc các đột biến liên quan đến bệnh.
References
- Basepair. Tutorial on Whole Exome Sequencing Analysis. Retrieved March 12, 2024 from https://www.basepairtech.com/knowledge-center/tutorial-on-whole-exome-sequencing-analysis/
- CD Genomics. Principles and Workflow of Whole Exome Sequencing. Retrieved March 12, 2024 from https://www.cd-genomics.com/resourse-principles-and-workflow-of-whole-exome-sequencing.html
- Illumina. Targeted sequencing to detect exonic variants. Retrieved March 12, 2024 from https://www.illumina.com/techniques/sequencing/dna-sequencing/targeted-resequencing/exome-sequencing.html
- National Genomics Education Programme. Whole exome sequencing. Retrieved March 12, 2024 from https://www.genomicseducation.hee.nhs.uk/genotes/knowledge-hub/whole-exome-sequencing/
- Novogene. WGS vs WES: Which Genetic Sequencing Method is Right for You?. Retrieved March 12, 2024 from https://www.novogene.com/us-en/resources/blog/wgs-vs-wes-which-genetic-sequencing-method-is-right-for-you/
- ScienceDirect. Clinical Applications for Next-Generation Sequencing. Retrieved March 12, 2024 from https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/B9780128017395000015
- Technology Networks. Applications of Whole Exome Sequencing. Retrieved March 12, 2024 from https://www.technologynetworks.com/genomics/lists/applications-of-whole-exome-sequencing-356897