Giải trình tự protein

Giải trình tự protein là gì?

Protein trong cơ thể được tạo thành từ hơn 20 loại axit amin. Các axit amin này sắp xếp theo thứ tự nhất định để tạo thành chuỗi axit amin tuyến tính, chiều bắt đầu từ nhóm -NH₂ (đầu N) đến nhóm -COOH (đầu C). Giải trình tự protein là quá trình xác định thứ tự cụ thể của những axit amin cấu thành nên phân tử protein.

Thông qua trình tự axit amin, người ta có thể dự đoán cấu trúc không gian 3 chiều của phân tử protein nhằm có thêm thông tin về chức năng sinh học, khả năng tương tác với phân tử khác và cách thức tham gia vào con đường sinh hóa phức tạp của protein mục tiêu.

Phương pháp thực hiện

Phân hủy Edman

Phương pháp phân hủy Edman do nhà khoa học Pehr Edman phát triển vào năm 1950 là phương pháp cổ điển và phổ biến nhất trong giải trình tự protein. Phương pháp này lần lượt tách từng axit amin ra khỏi chuỗi peptide, sau đó xác định tên của từng loại axit amin đó. Các bước thực hiện của phương pháp này bao gồm.

Bước 1. Gắn phenyl isothiocyanate (PITC)

Người ta thêm phenyl isothiocyanate (PITC) vào mẫu. Chất này có thể gắn vào đầu N của axit amin. Phản ứng gắn này diễn ra trong môi trường kiềm, vì vậy, người ta thường sử dụng dung dịch đệm có độ pH cao nhằm đảm bảo phản ứng diễn ra hiệu quả.

Bước 2. Tách axit amin ra khỏi chuỗi

Phân tử protein gắn PITC sau đó được xử lí bằng axit. Quá trình này làm cắt đứt liên kết giữa axit amin gắn PITC với phần còn lại của chuỗi protein. Người ta gọi phức hợp được giải phóng sau phản ứng là PTH-axit amin.

Bước 3. Xác định axit amin

Phức hợp PTH-axit amin di chuyển qua cột sắc kí lỏng. Mỗi loại PTH-axit amin có thời gian di chuyển qua cột khác nhau dựa trên đặc tính của từng loại axit amin. Dựa vào đó, người ta có thể xác định chính xác tên từng loại axit amin được cắt ra.

Phương pháp phân hủy Edman có thể xác định trình tự của các peptide nhỏ (chiều dài khoảng 30–50 axit amin) với độ chính xác cao. Do đó, người ta xem phương pháp này là tiêu chuẩn vàng trong phân tích trình tự protein. Tuy nhiên, phương pháp phân hủy Edman không thể phân tích hỗn hợp protein phức tạp. Ngoài ra, mỗi chu kì phân hủy tốn nhiều thời gian (khoảng 45 phút). Mặt khác, trong nhiều trường hợp, đầu N của protein có thể bị biến đổi hóa học (acetyl hóa hoặc methyl hóa). Những biến đổi này ngăn cản PITC gắn với axit amin, dẫn đến gián đoạn quá trình giải trình tự.

Khối phổ

Khối phổ (mass spectrometry) là phương pháp hiện đại và phổ biến nhất hiện nay để giải trình tự protein. Phương pháp này dựa trên cơ chế ion hóa phân tử protein và phân tích khối lượng của chúng để xác định trình tự axit amin. Các bước thực hiện của phương pháp này bao gồm.

Bước 1. Chuẩn bị mẫu

Người ta sử dụng kĩ thuật sắc kí để phân hủy protein thành các đoạn peptide ngắn dựa trên cấu trúc và tính chất hóa học của chúng.

Bước 2. Ion hóa

Quá trình ion hóa biến đổi phân tử protein hoặc peptide từ trạng thái bình thường thành các ion mang điện tích. Hai phương pháp chính dùng để ion hóa protein hoặc peptide gồm ion hóa bằng điện phun hoặc ion hóa bằng laser.

Trong phương pháp ion hóa bằng điện phun, dung dịch chứa mẫu protein hoặc peptide được bơm qua ống mao dẫn kim loại và đặt trong điện trường mạnh. Đối với ion hóa bằng laser, người ta cố định protein trên một ma trận hóa học, sau đó dùng laser bắn phá protein thành các mảnh nhỏ mang điện tích.

Bước 3. Phân tích phổ khối

Máy khối phổ tạo ra điện trường mạnh làm cho ion di chuyển với tốc độ cao. Tốc độ này phụ thuộc vào tỉ lệ khối lượng trên điện tích (m/z) của ion. Sau quá trình ion hóa, các ion đi qua hệ thống phân tách. Tại đây, chúng được tách ra dựa trên tỉ lệ m/z.

Bước 4. Xác định trình tự

Người ta sử dụng dầu dò tạo ra tín hiệu điện tương ứng để nhận biết ion, tín hiệu này được ghi lại và chuyển thành khối phổ. Khối phổ này cung cấp thông tin về khối lượng ion trong mẫu, dựa vào đó, người ta có thể xác định trình tự axit amin của protein.

Phương pháp khối phổ có thể phân tích chuỗi protein có kích thước lớn và phức tạp hơn so với phân hủy Edman. Bên cạnh đó, chúng có thể xác định trình tự nhanh chóng và tương đối chính xác. Tuy nhiên, phương pháp khối phổ yêu cầu thiết bị đắt tiền và đòi hỏi người thực hiện có trình độ kĩ thuật cao.

Ứng dụng của giải trình tự protein

Phát triển thuốc

Giải trình tự protein đóng vai trò then chốt đối với quá trình khám phá và phát triển thuốc. Thông qua giải trình tự cấu trúc bậc một của protein đích, người ta có thể thiết kế thuốc phân tử nhỏ hoặc thuốc sinh học tương tác đặc hiệu với protein mục tiêu. Cách tiếp cận mục tiêu này tạo cơ sở phát triển các liệu pháp điều trị mới.

Một số ứng dụng của giải trình tự protein trong phát triển thuốc và liệu pháp điều trị bao gồm.

Liệu pháp nhắm trúng đích trong điều trị ung thư

Giải trình tự protein liên quan đến ung thư giúp người ta hiểu rõ hơn về chức năng của protein này đối với quá trình phát triển và tăng sinh của tế bào ung thư. Dựa trên những thông tin này, người ta phát triển các loại thuốc nhắm trúng đích như imatinib (Gleevec). Thuốc imatinib ức chế hoạt động của tyrosine kinase—protein hoạt động quá mức trong tế bào ung thư, do đó làm giảm hoặc ngăn chặn quá trình phát triển bệnh bạch cầu dòng tủy mãn tính.

Kháng thể đơn dòng

Giải trình tự protein giúp xác định chính xác vị trí epitope trên protein. Epitope là yếu tố quyết định kháng nguyên, kháng nguyên cần có epitope để có thể tương tác với kháng thể.

Thông qua phân tích trình tự protein của tế bào ung thư hoặc tế bào bất thường khác, người ta có thể xác định epitope đặc trưng hiện diện trên bề mặt của các tế bào này. Sau đó, người ta sản xuất kháng thể đơn dòng dựa trên kết quả này nhằm nhận diện và gắn vào những epitopes cụ thể.

Vaccine cho virus

Phân tích trình tự protein của virus có thể cung cấp thông tin về đặc tính sinh học, khả năng gây bệnh và mối quan hệ tiến hóa của virus. Từ các thông tin trên, người ta chọn ra những protein có tiềm năng trở thành kháng nguyên nhằm sản xuất vaccine phòng ngừa bệnh do virus gây ra.

Ngoài ra, giải trình tự protein còn giúp tối ưu hóa thuốc, giảm tác dụng phụ và cải thiện hiệu quả điều trị. Người ta hi vọng phương pháp tiếp cận dựa trên trình tự protein mang lại những bước đột phá trong quá trình phát triển thuốc điều trị nhiều bệnh khác nhau.

Y học cá nhân hóa

Giải trình tự protein rất quan trọng đối với y học cá nhân hóa. Thông qua xác định biến thể đa hình protein liên quan đến cơ chế bệnh lí và đáp ứng điều trị, người ta sẽ xây dựng phác đồ điều trị phù hợp nhằm mang lại hiệu quả tốt nhất cho từng cá nhân.

Công nghệ sinh học

Đối với lĩnh vực công nghệ sinh học, giải trình tự protein là công cụ không thể thiếu trong quá trình phát triển, sản xuất dược phẩm sinh học, protein tái tổ hợp và enzyme. Bên cạnh đó, người ta có thể thay đổi trình tự axit amin nhằm tăng cường hiệu quả xúc tác và độ đặc hiệu của enzyme với cơ chất tương ứng.

Hạn chế của giải trình tự protein

Giải trình tự protein có một số hạn chế như sau:

• Quá trình chuẩn bị mẫu phức tạp
• Hạn chế trong phân tích kết quả giải trình tự
• Chi phí thực hiện cao

Một số cải tiến về công nghệ giúp khắc phục hạn chế

Giải trình tự thông lượng cao

Những kĩ thuật giải trình tự protein hiện đại cho phép phân tích đồng thời hàng ngàn protein trong một mẫu. Điều này mở ra nhiều cơ hội mới cho nghiên cứu toàn bộ hệ protein (proteome) của tế bào, mô hay cơ quan trong nhiều điều kiện khác nhau, do đó giúp chúng ta hiểu rõ hơn vai trò và chức năng của các protein.

Cải tiến khối phổ

Hiện nay, thiết bị khối phổ có độ nhạy và chính xác cao hơn, chúng cho phép phát hiện và định lượng protein có hàm lượng thấp trong mẫu. Ngoài ra, phần mềm phân tích dữ liệu khối phổ cũng hoàn thiện hơn, tăng độ chính xác trong quá trình xác định danh tính và trình tự của protein.

Phương pháp tiếp cận lai

Phương pháp tiếp cận lai kết hợp ưu điểm của cả hai kĩ thuật phân hủy Edman và khối phổ, điều này giúp tăng khả năng giải trình tự và độ chính xác.

Giải trình protein bằng tín hiệu huỳnh quang

Người ta đánh dấu một số axit amin hoặc các đoạn peptide trong protein bằng phân tử huỳnh quang. Các tín hiệu huỳnh quang này sẽ phát ra trong quá trình xử lí protein, dựa vào đó, người ta có thể xác định trình tự protein.

Giải trình tự protein bằng dòng điện xuyên hầm (tunnelling currents)

Trong phương pháp giải trình tự protein bằng dòng điện xuyên hầm, protein hoặc các đoạn peptide sẽ di chuyển qua một cặp điện cực nano và làm thay đổi dòng điện. Mỗi loại axit amin trên protein tạo ra một tín hiệu điện khác nhau, do đó, người ta có thể nhận dạng từng axit amin khi protein hoặc các đoạn peptide đi qua cặp điện cực.

Giải trình tự protein bằng nanopore

Đối với phương pháp giải trình tự protein bằng nanopore, một màng mỏng chứa nanopore được đặt giữa hai ngăn chứa dung dịch điện phân. Nanopore là các lỗ rất nhỏ có kích thước nanomet (1/1.000.000.000 mét). Các ion sẽ chảy dần qua lỗ nanopore khi được cung cấp điện áp. Protein hoặc các đoạn peptide sẽ di chuyển qua nanopore và làm thay đổi dòng ion chảy qua lỗ này. Mỗi loại axit amin trên protein làm thay đổi dòng ion theo hướng khác nhau, do đó, người ta có thể nhận dạng từng trình tự axit amin.

Lời kết

Giải trình tự protein là kĩ thuật quan trọng đối với nghiên cứu sinh học phân tử và y sinh. Kĩ thuật này cung cấp thông tin chi tiết về thành phần và cấu trúc của protein, từ đó người ta có thể nghiên cứu về chức năng cũng như cách thức protein tham gia vào các quá trình sinh học phức tạp trong cơ thể. Tuy kĩ thuật này vẫn còn một số hạn chế nhưng hiện nay, công nghệ phát triển làm giải trình tự protein ngày càng trở nên nhanh chóng, chính xác và hiệu quả hơn.