Giải trình tự không gian

Mỗi tế bào trong cơ thể con người được sắp xếp theo một cấu trúc không gian đặc trưng trong các mô và cơ quan. Cấu trúc này quyết định cách tế bào tương tác với các tế bào lân cận và môi trường xung quanh, từ đó ảnh hưởng đến chức năng và hoạt động của chúng. Các phương pháp nghiên cứu truyền thống như RNA-seq thường yêu cầu nghiền nát mô thành hỗn hợp đồng nhất để phân tích, dẫn đến tình trạng mất hoàn toàn thông tin về vị trí không gian của các tế bào.

Sự mất mát thông tin này tạo ra những hạn chế nghiêm trọng trong nghiên cứu nhiều loại mô và bệnh lí:

• Trong khối u ung thư, các tế bào có thể biểu hiện gen khác nhau tùy thuộc vào vị trí của chúng trong khối u, dẫn đến khả năng đáp ứng với thuốc khác nhau.

• Trong não bộ, các tế bào thần kinh và tế bào thần kinh đệm phân bố theo mô hình không gian phức tạp, quyết định chức năng của từng vùng não.
• Trong quá trình phát triển phôi, vị trí của tế bào trong phôi thai quyết định số phận biệt hóa của chúng.

Công nghệ giải trình tự không gian (spatial transcriptomics) ra đời nhằm giải quyết vấn đề này bằng cách phân tích biểu hiện gen trong khi vẫn giữ nguyên thông tin về vị trí không gian của tế bào trong mô.

Các công nghệ giải trình tự không gian

1. Phương pháp dựa trên lai phân tử

Phương pháp này phát hiện ARN trực tiếp tại vị trí ban đầu của chúng trong mô thông qua quá trình lai với các đoạn ADN bổ sung (đầu dò).

seqFISH (Sequential Fluorescence In Situ Hybridization)

Trong phương pháp seqFISH, mô được cố định và xử lí nhằm bảo quản cấu trúc tế bào và các phân tử ARN. Quá trình phân tích được thực hiện thông qua nhiều chu kì lai phân tử liên tiếp. Mỗi chu kì nhắm vào một nhóm gen cụ thể nhằm xác định vị trí và mức độ biểu hiện trong mô. Đầu tiên, các đoạn ADN ngắn (đầu dò) được thiết kế chuyên biệt nhằm bắt cặp bổ sung với ARN mục tiêu. Các đầu dò này được gắn với các chất phát huỳnh quang có màu sắc khác nhau. Khi đi vào mô, các đầu dò sẽ tìm và gắn kết với ARN mục tiêu thông qua quá trình lai phân tử. Đây là quá trình trong đó hai chuỗi nucleotide bổ sung nhau kết hợp lại với nhau.

Sau khi quá trình lai hoàn tất, mô được chụp ảnh bằng kính hiển vi huỳnh quang độ phân giải cao. Hình ảnh này ghi lại vị trí chính xác của các tín hiệu huỳnh quang, tương ứng với vị trí của ARN mục tiêu trong mô. Sau mỗi lần chụp ảnh, các đầu dò được loại bỏ hoàn toàn khỏi mô trước khi bắt đầu chu kì tiếp theo, nhằm tránh nhiễu tín hiệu giữa các chu kì.

Qui trình này được lặp lại nhiều lần, mỗi lần với tập hợp đầu dò nhắm vào các gen khác nhau. Cuối cùng, tất cả dữ liệu hình ảnh từ các chu kì được kết hợp lại bằng phần mềm chuyên dụng nhằm tạo thành một bản đồ biểu hiện gen toàn diện có thông tin không gian, cho phép các nhà nghiên cứu xác định vị trí và mức độ biểu hiện của hàng nghìn gen khác nhau trong mô.

MERFISH (Multiplexed Error-Robust FISH)

Trong phương pháp này, mỗi loại ARN được gán một mã nhị phân duy nhất, tức là một chuỗi các số 0 và 1. Để đọc được mã này, nhiều vòng lai phân tử được thực hiện, mỗi vòng kiểm tra một vị trí cụ thể (bit) trong mã nhị phân.

Các đầu dò lai được thiết kế gồm hai phần:

• Phần nhận diện gen gắn với ARN mục tiêu theo nguyên tắc bổ sung
• Phần đọc mã (readout sequence) chứa nhiều vùng đọc mã, mỗi vùng tương ứng với một bit. Cụ thể, tại vị trí bit “1”, vùng đọc mã được thiết kế nhằm bổ sung với đầu dò thứ cấp, trong khi tại vị trí bit “0”, vùng đọc mã không thể liên kết với đầu dò thứ cấp.

Trong mỗi vòng, đầu dò thứ cấp mang chất huỳnh quang được thiết kế nhằm gắn vào vùng đọc mã tương ứng với bit “1”, tạo tín hiệu huỳnh quang có thể quan sát được qua kính hiển vi. Bằng cách lặp lại quá trình này qua nhiều vòng, mỗi vòng kiểm tra một bit khác nhau, hệ thống dần dần xây dựng mã nhị phân hoàn chỉnh cho từng phân tử ARN.

2. Phương pháp dựa trên giải trình tự

Phương pháp này sử dụng các công nghệ giải trình tự thế hệ mới kết hợp với thông tin không gian.

Visium (10x Genomics)

Visium là phương pháp giải trình tự không gian phổ biến dựa trên nguyên lí bắt giữ ARN và giải trình tự. Phương pháp này sử dụng tấm kính chuyên biệt có chứa hàng nghìn vị trí bắt giữ ARN được bố trí theo một mạng lưới đều đặn. Mỗi vị trí bắt giữ chứa hàng triệu đoạn oligonucleotide ngắn được gắn cố định vào bề mặt kính.

Cấu trúc của mỗi oligonucleotide này rất quan trọng và bao gồm ba thành phần chính:

• Mã vạch không gian duy nhất: trình tự nucleotide được gắn tại mỗi vị trí cụ thể trên tấm kính. Nhờ mã vạch không gian này, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác vị trí ban đầu của mỗi phân tử ARN trong mô để tạo ra bản đồ biểu hiện gen theo không gian.
• Mã vạch phân tử duy nhất (Unique Molecular Identifier – UMI): trình tự ngắn ngẫu nhiên được gắn vào mỗi phân tử ARN trong quá trình thu nhận mẫu. Mỗi bản sao ARN ban đầu được gắn một UMI riêng biệt. Trong các bước xử lí tiếp theo, ARN thường phải trải qua quá trình khuếch đại PCR nhằn tạo ra nhiều bản sao từ một phân tử. UMI nhận diện các bản sao này là từ cùng một phân tử ARN gốc, từ đó chúng loại bỏ sai số do khuếch đại và định lượng chính xác số lượng phân tử ARN ban đầu trong mẫu.
• Đoạn poly(T): chuỗi các nucleotide thymine (T) được thiết kế nhằm bắt giữ các phân tử ARN có đuôi poly(A). Phần lớn các mRNA trong tế bào nhân thực đều có đuôi poly(A) (một chuỗi nucleotide adenine) tại đầu 3′. Cơ chế này đảm bảo chỉ có mRNA được bắt giữ, từ đó tính đặc hiệu của kĩ thuật được nâng cao.

Một lát cắt mô mỏng được đặt lên trên tấm kính. Mô được xử lí nhằm giải phóng ARN ra ngoài tế bào, nhưng vẫn giữ nguyên vị trí không gian tương đối. Các phân tử ARN được giải phóng di chuyển một khoảng cách ngắn và bị bắt giữ bởi các oligonucleotide gần nhất thông qua quá trình lai giữa đuôi poly(A) của ARN và đoạn poly(T) của oligonucleotide.

Sau khi ARN được bắt giữ, enzyme phiên mã ngược được thêm vào nhằm chuyển đổi ARN thành cDNA ngay tại chỗ, gắn liền với các oligonucleotide trên bề mặt kính. Tiếp theo, cDNA được thu thập, khuếch đại và đưa vào máy giải trình tự thế hệ mới nhằm xác định trình tự nucleotide.

Mỗi đoạn trình tự ARN đọc được sẽ mang theo mã vạch không gian, cho phép phần mềm phân tích vị trí gen được biểu hiện trong mô.

Stereo-seq (STOmics)

Stereo-seq là một phương pháp tiên tiến hơn dựa trên nguyên lí tương tự như Visium, nhưng với độ phân giải cao hơn đáng kể. Thay vì sử dụng các vị trí bắt giữ có kích thước tương đối lớn, Stereo-seq sử dụng công nghệ ADN microarray tiên tiến với mật độ cực cao.

Trong Stereo-seq, các oligonucleotide được gắn vào các vi hạt cực nhỏ, có kích thước dưới 1 micromet. Mỗi vi hạt này chứa một mã vạch không gian độc nhất để xác định vị trí chính xác trên tấm đế. Độ phân giải này có thể đạt đến cấp độ tế bào đơn, thậm chí có thể phân biệt các vùng khác nhau trong cùng một tế bào, vượt trội so với độ phân giải của Visium.

Quy trình bắt giữ ARN và giải trình tự trong Stereo-seq về cơ bản tương tự như trong Visium. Mô được đặt lên chip, ARN được giải phóng và bắt giữ bởi các oligonucleotide, sau đó được chuyển đổi thành cDNA, khuếch đại và giải trình tự. Điểm khác biệt chính là mật độ cao hơn của các điểm bắt giữ và các cải tiến kĩ thuật cho phép thu thập thông tin chi tiết hơn.

Độ phân giải cao của Stereo-seq cho phép phân tích sâu hơn về sự không đồng nhất của mô và tương tác giữa các tế bào tại cấp độ đơn bào. Kĩ thuật này rất hữu ích khi nghiên cứu các mô phức tạp như não bộ hoặc khối u ung thư, nơi có nhiều loại tế bào khác nhau cùng tồn tại trong không gian nhỏ.

3. Phương pháp dựa trên vi phẫu

Phương pháp này cô lập chính xác các vùng mô cụ thể trước khi phân tích.

GeoMx DSP (Digital Spatial Profiling)

GeoMx DSP là phương pháp phân tích không gian dựa trên nguyên lí vi phẫu chọn lọc kết hợp với kĩ thuật định lượng phân tử. Mô được xử lí bằng các kháng thể hoặc đầu dò nucleic acid đã được gắn với các chất quang hóa đặc biệt. Các kháng thể này có thể nhận diện các protein cụ thể, trong khi các đầu dò nucleic acid nhận diện các loại ARN mục tiêu trong mô.

Sau khi được xử lí và đánh dấu, mô được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang nhằm xác định các vùng quan tâm. Các vùng này có thể là nhóm tế bào cụ thể hoặc cấu trúc mô chuyên biệt. Khi các vùng quan tâm đã được xác định, tia laser UV được điều khiển chính xác để chiếu lên từng vùng. Tia UV phá vỡ liên kết của các chất đánh dấu quang hóa và giải phóng các chất này. Sau đó, thông qua các kĩ thuật định lượng có độ nhạy cao, người ta thu được bản đồ chi tiết về biểu hiện gen và protein trong từng vùng mô.

CosMx SMI (Single Molecule Imaging)

CosMx SMI là phương pháp tiên tiến kết hợp kĩ thuật vi phẫu với phân tích phân tử tại chỗ với độ phân giải cực cao. Điểm đặc biệt của CosMx SMI là khả năng phân tích đồng thời cả ARN và protein trong cùng một mẫu mô, mang lại cái nhìn toàn diện về trạng thái phân tử của tế bào trong bối cảnh không gian.

Tương tự với công nghệ GeoMx DSP, mô cũng được xử lí với các đầu dò đánh dấu đặc hiệu. Sau đó, CosMx sử dụng hệ thống quang học độ phân giải cực cao để chụp ảnh mẫu. Hệ thống này có khả năng chụp ảnh tại cấp độ phân tử đơn, nghĩa là có thể phát hiện và định vị từng phân tử ARN hoặc protein riêng biệt trong mô. Các hình ảnh được phân tích bằng phần mềm chuyên dụng nhằm xác định vị trí chính xác của mỗi phân tử ARN hoặc protein trong mô.

Ứng dụng

Phân tích sự đa dạng trong khối u

Giải trình tự không gian cho phép các nhà khoa học nghiên cứu sự khác biệt giữa các vùng trong khối u với độ chi tiết cao. Bằng cách xem xét các gen hoạt động tại từng vị trí cụ thể, các nhà nghiên cứu có thể xác định những vùng khác nhau trong khối u. Do đó, họ hiểu rõ hơn về cách khối u phát triển và tại sao một số vùng có thể kháng lại thuốc điều trị, từ đó phương pháp điều trị phù hợp hơn cho từng bệnh nhân có thể được vạch ra.

Nghiên cứu môi trường xung quanh khối u

Môi trường xung quanh khối u có vai trò quan trọng trong sự phát triển của ung thư. Công nghệ giải trình tự không gian cho phép nghiên cứu đồng thời cả tế bào ung thư và các tế bào xung quanh. Nhờ đó, người ta có thể hiểu rõ hơn về mối quan hệ giữa tế bào ung thư và các tế bào lân cận cũng như tác động của môi trường này đến sự phát triển của bệnh.

Tìm hiểu quá trình di căn

Công nghệ này mang lại những hiểu biết mới về cách ung thư di căn đến các bộ phận khác trong cơ thể. Bằng cách so sánh các gen hoạt động tại khối u ban đầu và tại các vị trí di căn, người ta có thể xác định những yếu tố thúc đẩy quá trình di căn. Những thông tin này rất quan trọng để phát triển các phương pháp ngăn chặn sự lây lan của ung thư.

Đánh giá hiệu quả của liệu pháp miễn dịch

Liệu pháp miễn dịch là phương pháp điều trị giúp kích thích hệ miễn dịch chống lại tế bào ung thư. Giải trình tự không gian có thể cho thấy rõ chi tiết sự tương tác giữa tế bào ung thư và hệ miễn dịch tại các vị trí cụ thể trong khối u. Từ đó, bác sĩ có thể dự đoán và đánh giá hiệu quả của liệu pháp miễn dịch cũng như tìm ra cách cải thiện phương pháp điều trị này.

Phát hiện dấu hiệu sinh học mới

Giải trình tự không gian có khả năng phát hiện các dấu hiệu sinh học mới giúp chẩn đoán, tiên lượng và điều trị ung thư. Bằng cách phân tích các gen hoạt động tại các vị trí khác nhau trong khối u, người ta có thể tìm ra những gen hoặc nhóm gen liên quan đến các đặc điểm quan trọng của bệnh ung thư. Những dấu hiệu này có thể được sử dụng trong chẩn đoán sớm, dự đoán tiến triển bệnh và lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp cho từng bệnh nhân.

Lời kết

Giải trình tự không gian là bước tiến quan trọng trong nghiên cứu sinh học phân tử, bổ sung chiều không gian vào phân tích biểu hiện gen. Công nghệ này đã và đang mở ra những cơ hội mới để hiểu sâu sắc hơn về cấu trúc và chức năng của mô trong trạng thái bình thường và bệnh lí. Trong tương lai, công nghệ này có khả năng trở thành công cụ không thể thiếu trong sinh học hiện đại, y học chính xác và phát triển thuốc mới.