Xét nghiệm ELISA và ứng dụng

Xét nghiệm ELISA là gì?

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) là kĩ thuật xét nghiệm sinh hóa cơ bản được sử dụng nhằm phát hiện và đo lường kháng thể, hormone, peptide và protein trong mẫu dịch lỏng. Kĩ thuât này được hai nhà khoa học Peter Perlmann và Eva Engvall tại Viện Karolinska (Thụy Điển) phát triển vào đầu những năm 1970.

ELISA có thể đo lường chính xác mức độ kháng thể hoặc các loại protein khác trong mẫu. Điều này rất quan trọng đối với nghiên cứu và chẩn đoán lâm sàng, chúng giúp xác định mức độ nghiêm trọng của bệnh hoặc đánh giá chuẩn xác hiệu quả điều trị.

Nguyên lý cơ bản của kĩ thuật ELISA

Kĩ thuật ELISA hoạt động dựa trên tương tác đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Trong đó, kháng nguyên là phân tử protein mục tiêu cần phát hiện trong mẫu, kháng thể là protein có thể nhận diện và liên kết chọn lọc với kháng nguyên.

Đầu tiên, kháng nguyên hoặc kháng thể được cố định lên bề mặt rắn, ví dụ như đĩa 96 giếng có phủ nhựa PolyStyrene. Thành phần còn lại được gắn với enzyme, sau đó thêm chúng vào giếng để liên kết với kháng nguyên hoặc kháng thể đã cố định. Những phân tử không có khả năng liên kết sẽ được loại bỏ.

Sau khi rửa sạch các vật liệu không liên kết, người ta đưa vào đó cơ chất enzyme. Enzyme sẽ xúc tác phản ứng biến đổi chất nền trong mẫu thành sản phẩm có màu hoặc phát huỳnh quang. Cường độ tín hiệu tạo ra tỉ lệ với lượng phân tử mục tiêu có trong mẫu. Cường độ tín hiệu này được đo bằng thiết bị đọc, sau đó chúng được chuyển thành nồng độ protein trong mẫu.

Quy trình thực hiện tổng quát

Bước 1: phủ (coating)

Mục đích: cố định kháng nguyên hoặc kháng thể vào bề mặt đĩa.

Quy trình:

• Thêm dung dịch chứa kháng nguyên hoặc kháng thể bắt giữ vào các giếng của đĩa vi thể
• Ủ trong khoảng thời gian nhất định (qua một đêm) với nhiệt độ thích hợp để diễn ra liên kết giữa kháng nguyên và kháng thể
• Rửa giếng để loại bỏ kháng nguyên hoặc kháng thể không liên kết

Bước 2: chặn (blocking)

Mục đích: ngăn kháng thể bám vào vị trí không đặc hiệu trên đĩa, qua đó đảm bảo kháng thể chỉ liên kết với kháng nguyên mục tiêu.

Quy trình:

• Thêm các chất như BSA, ovalbumin, aprotinin hoặc protein thương mại vào đĩa
• Ủ trong khoảng thời gian nhất định tại nhiệt độ phòng
• Rửa giếng để loại bỏ dung dịch chặn dư

Bước 3: ủ mẫu

Mục đích: tạo điều kiện cho kháng nguyên liên kết với kháng thể.

Quy trình:

• Thêm mẫu chứa kháng thể hoặc kháng nguyên vào giếng
• Ủ trong khoảng thời gian nhất định với nhiệt độ thích hợp
• Rửa giếng để loại bỏ phân tử không liên kết

Bước 4: ủ kháng thể phát hiện

Mục đích: giúp kháng thể gắn enzyme liên kết với kháng thể hoặc kháng nguyên mục tiêu.

Quy trình:

• Thêm kháng thể thứ cấp có gắn enzyme đặc hiệu với kháng thể hoặc kháng nguyên đã cố định ban đầu vào các giếng
• Ủ trong khoảng thời gian nhất định với nhiệt độ thích hợp
• Rửa giếng để loại bỏ kháng thể thứ cấp không liên kết

Bước 5: bổ sung cơ chất

Mục đích: cho phép enzyme xúc tác phản ứng tạo ra tín hiệu màu sắc hoặc phát hình quang.

Quy trình:

• Thêm dung dịch cơ chất để enzyme có thể chuyển hóa thành sản phẩm có thể nhận diện bằng tín hiệu màu sắc hoặc phát hình quang
• Ủ đến khi màu phát triển tới cường độ mong muốn

Bước 6: dừng phản ứng

Mục đích: dừng hoạt động của enzyme nhằm cố định tín hiệu.

Quy trình: thêm dung dịch dừng vào các giếng để dừng phản ứng enzyme-cơ chất.

Bước 7: đo tín hiệu

Mục đích: xác định mức độ hiện diện và định lượng protein mục tiêu trong mẫu.

Quy trình:

• Đo độ hấp thụ của mỗi giếng bằng máy đọc đĩa tại bước sóng thích hợp
• So sánh giá trị độ hấp thụ với đường chuẩn hoặc mẫu tham chiếu nhằm định lượng nồng độ của phân tử mục tiêu trong mẫu

Các loại xét nghiệm ELISA

ELISA trực tiếp

Đối với kĩ thuật ELISA trực tiếp, người ta thêm kháng nguyên vào đĩa, sau đó ủ tại điều kiện thích hợp nhằm giúp kháng nguyên bám lên bề mặt. Tiếp theo, kháng thể gắn enzyme được thêm vào và cuối cùng, enzyme được bổ sung cơ chất. Enzyme tác động lên cơ chất làm chúng chuyển sang dạng có màu hoặc phát huỳnh quang.

ELISA trực tiếp là kĩ thuật đơn giản nhất nên thời gian thực hiện ngắn hơn so với các phương pháp ELISA khác. Tuy nhiên, phương pháp này có độ nhạy thấp. Bên cạnh đó, người ta phải tạo nhiều loại kháng thể gắn enzyme tương ứng với mỗi kháng nguyên khác nhau. Do đó, ELISA trực tiếp khá tốn kém và thiếu linh hoạt.

ELISA gián tiếp

Kĩ thuật ELISA gián tiếp cũng bắt đầu bằng cách phủ kháng nguyên trong đĩa. Tuy nhiên, ELISA gián tiếp yêu cầu hai kháng thể gồm một kháng thể chính liên kết với protein mục tiêu cần định lượng và một kháng thể thứ cấp liên hợp enzyme phù hợp với kháng thể chính. Kháng thể chính được thêm vào trước, sau đó thêm kháng thể thứ cấp liên hợp enzyme vào và ủ. Những bước sau tương tự như ELISA gián tiếp.

ELISA gián tiếp có độ nhạy cao hơn so với ELISA trực tiếp, do vậy phương pháp này được sử dụng để phát hiện phân tử mục tiêu có nồng độ thấp. Ngoài ra, người ta chỉ cần sản xuất kháng thể chính tương ứng với mỗi kháng nguyên khác nhau và không cần gắn enzyme. Do đó, ELISA gián tiếp ít tốn kém và độ linh hoạt cao hơn ELISA trực tiếp. Tuy nhiên, nếu mẫu chứa các loại kháng thể hoặc protein mà kháng thể thứ cấp liên hợp enzyme có thể liên kết có thể dẫn đến kết quả dương tính giả.

ELISA sandwich

Phương pháp này tên là ELISA sandwich vì kháng nguyên nằm giữa hai lớp kháng thể (kháng thể bắt giữ và kháng thể phát hiện). Khác với hai phương pháp trên, bước đầu tiên của ELISA sandwich là phủ một lớp kháng thể lên bề mặt giếng của đĩa. Tiếp theo, kháng nguyên mục tiêu được thêm vào đĩa để liên kết với kháng thể bắt giữ. Sau đó, kháng thể thứ cấp gắn enzyme được thêm vào và liên kết với phức hợp kháng nguyên-kháng thể bắt giữ. Cuối cùng, người ta thêm cơ chất vào nhằm cung cấp tín hiệu phát hiện.

ELISA sandwich có độ nhạy cao nhất trong tất cả các loại xét nghiệm ELISA. Nhược điểm chính của phương pháp này là chi phí cao và thời gian thưc hiện lâu. Ngoài ra, kĩ thuật này còn yêu cầu hai loại kháng thể có thể liên kết với kháng nguyên mục tiêu.

ELISA cạnh tranh

ELISA cạnh tranh là phương pháp xét nghiệm miễn dịch dựa trên nguyên lí cạnh tranh giữa kháng thể trong mẫu thử và kháng thể đã biết trong hoạt động liên kết với kháng nguyên. Kháng nguyên đã biết được cố định sẵn trên bề mặt đĩa thí nghiệm. Sau đó, người ta thêm mẫu thử bao gồm kháng thể cần định lượng và kháng thể đã biết gắn enzyme (kháng thể đối chứng) vào đĩa.

Kháng thể mục tiêu và kháng thể đối chứng sẽ cạnh tranh nhau để liên kết với kháng nguyên cố định. Khi thêm cơ chất vào, enzyme sẽ phân giải chất nền và tạo ra tín hiệu màu. Nếu nồng độ kháng thể mục tiêu trong mẫu cao, chúng sẽ liên kết với kháng nguyên và ngăn cản kháng thể đối chứng liên kết, dẫn đến tín hiệu màu thấp. Ngược lại, nếu mẫu có ít kháng thể mục tiêu, kháng thể đối chứng sẽ dễ dàng liên kết với kháng nguyên, do đó tín hiệu màu sẽ cao hơn.

Ứng dụng của kĩ thuật ELISA

Y tế

ELISA được sử dụng để phát hiện bệnh truyền nhiễm dựa trên cơ chế nhận diện protein của vi khuẩn, virus và kí sinh trùng gây bệnh.

Một số bệnh truyền nhiễm được phát hiện bằng ELISA bao gồm:

• Ebola
• AIDS
• Rotavirus
• Bệnh Lyme
• Giang mai
• Bệnh toxoplasmosis
• Virus Zika
• COVID-19

Bên cạnh chẩn đoán bệnh truyền nhiễm, kĩ thuật ELISA cũng đóng vai trò quan trọng đối với nhiều lĩnh vực khác của y học. ELISA có khả năng phát hiện kháng thể đặc hiệu do hệ miễn dịch sản xuất nhằm chống lại tác nhân gây dị ứng như phấn hoa, bụi hoặc thực phẩm. Vì vậy, bác sĩ có thể chẩn đoán chính xác tình trạng dị ứng và xác định rõ tác nhân gây dị ứng, qua đó đưa ra phác đồ điều trị phù hợp cho bệnh nhân.

ELISA còn được ứng dụng trong chẩn đoán bệnh tự miễn như lupus ban đỏ hệ thống, viêm khớp dạng thấp và bệnh đa xơ cứng. ELISA giúp xác định bệnh tự miễn bằng cách phát hiện những kháng thể hoặc tự kháng thể tấn công nhầm các mô khỏe mạnh trong cơ thể.

Trong lĩnh vực ung thư, kĩ thuật này được sử dụng nhằm phát hiện dấu ấn ung thư—chất đặc trưng do tế bào ung thư sản xuất. Dấu ấn ung thư có thể tìm thấy trong máu hoặc dịch cơ thể. Do đó, ELISA hỗ trợ chẩn đoán một số loại ung thư như ung thư tuyến tiền liệt và ung thư buồng trứng, qua đó mở ra cơ hội điều trị sớm và tăng khả năng thành công.

Ngoài ra, kĩ thuật ELISA cho phép theo dõi nồng độ thuốc trong máu nhằm đảm bảo hiệu quả điều trị, tránh nguy cơ thuốc quá liều hoặc ngộ độc. ELISA cũng được sử dụng nhằm phát hiện tình trạng lạm dụng ma túy thông qua đo nồng độ thuốc hoặc chất chuyển hóa của chúng trong nước tiểu.

Bên cạnh đó, ELISA còn có thể đo lường nồng độ một số hormone trong cơ thể như:

• Luteinizing: hormone kích thích nang trứng
• Prolactin: hormone liên quan đến sản xuất sữa của phụ nữ và hoạt động chức năng khác của tế bào
• Testosterone: hormone quan trọng đối với duy trì và phát triển đặc điểm thể chất, sinh lý điển hình trên nam giới
• Human chorionic gonadotropin (hCG): hormone được nhau thai sản xuất trong thời gian mang thai

Thông qua đó, ELISA giúp hỗ trợ chẩn đoán và điều trị các rối loạn nội tiết và sinh sản.

Nghiên cứu khoa học

ELISA thường được sử dụng nhằm định lượng nồng độ protein cụ thể trong mẫu, từ đó giúp nghiên cứu biểu hiện và điều hòa protein trong tế bào mô. Phương pháp ELISA cũng được ứng dụng trong sản xuất protein trị liệu nhằm xác nhận và định lượng mẫu protein vừa được sản xuất. Bên cạnh đó, người ta sử dụng ELISA nhằm phát hiện và định lượng kháng thể trong mẫu sinh học, ví dụ như huyết thanh hoặc huyết tương. Ứng dụng nay rất cần thiết để nghiên cứu cách hệ miễn dịch phản ứng với mầm bệnh hoặc vaccine.

Ngoài ra, ELISA cho phép sàng lọc hàng loạt hợp chất hóa học khác nhau để xác định khả năng liên kết của các hợp chất này với protein mục tiêu cụ thể. Khi một hợp chất liên kết mạnh với protein mục tiêu, hợp chất này có thể ức chế hoặc kích hoạt hoạt động của protein đó, qua đó tác động đến bệnh lí. Thông qua ELISA, người ta có thể nhanh chóng chọn lọc được những hợp chất có khả năng liên kết mạnh nhất nhằm nghiên cứu và phát triển thành thuốc điều trị.

Cuối cùng, người ta có thể sử dụng ELISA nhằm khám phá dấu ấn sinh học. Các phân tử có thể được sử dụng nhằm chỉ ra mức độ nghiêm trọng hoặc tiến triển của bệnh, từ đó phát triển biện pháp chẩn đoán, theo dõi và điều trị mới.

Thực phẩm

ELISA là phương pháp nhanh chóng, giá thành thấp giúp xác định chất gây dị ứng, mầm bệnh và các chất gây ngộ độc khác có trong thực phẩm. ELISA cũng được ứng dụng trong kiểm soát chất lượng sữa, cá, thực phẩm biến đổi gen, thực phẩm được chiếu xạ hoặc các loại thực phẩm khác có khả năng ảnh hưởng đến sức khỏe con người.

Môi trường

Đối với lĩnh vực quản lý chất lượng nước, ELISA được dùng để phát hiện nhiều chất độc hại như thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ, kim loại nặng và mầm bệnh nguy hiểm như E. coli. Bên cạnh đó, ELISA có khả năng nhận diện các chất gây ô nhiễm không khí như benzen, toluene và xylene được thải ra từ quy trình công nghiệp và giao thông. Do đó, ELISA rất hữu ích vì chúng cung cấp thông tin quan trọng về mức độ ô nhiễm.

Bên cạnh đó, ELISA cũng là công cụ phổ biến trong phân tích đất nhờ vào khả năng phát hiện chất gây ô nhiễm như kim loại nặng, thuốc trừ sâu và mầm bệnh trong đất.

Ngoài ra, ELISA còn được ứng dụng trong giám sát quy trình công nghiệp. ELISA giúp doanh nghiệp kiểm soát và xử lí chất thải hiệu quả vì chúng phát hiện có chất độc hại như kim loại nặng và dung môi hiện diện trong quá trình sản xuất hay không. Qua đó, phương pháp ELISA góp phần bảo vệ môi trường và sức khỏe người lao động.

Ưu điểm và hạn chế của kĩ thuật ELISA

Ưu điểm

• Chẩn đoán chính xác bệnh cụ thể
• Quy trình thực hiện phản ứng và phân tích dữ liệu khá đơn giản
• Cho kết quả nhanh chóng
• Độ tin cậy và độ nhạy cao
• Hóa chất sử dụng trong phản ứng phổ biến
• Không cần sử dụng chất phóng xạ và lượng lớn dung môi hữu cơ
• Thân thiện với môi trường

Hạn chế

• Không có khả năng phát hiện đồng thời nhiều phân tử mục tiêu trong một phản ứng
• Thể tích mẫu cần dùng tương đối lớn
• Không thể phát hiện khi protein mục tiêu có nồng độ thấp
• Không thể phát hiện bệnh trong giai đoạn đầu
• Quy trình chuẩn bị kháng thể tốn nhiều thời gian và chi phí cao
• Cần vận chuyển và lưu trữ kháng thể trong điều kiện lạnh

Lời kết

ELISA là phương pháp phổ biến, hiệu quả nhất nhằm phát hiện, định lượng tác nhân sinh học nhờ độ nhạy và đặc hiệu cao. Vì vậy, ELISA được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như y học, nghiên cứu khoa học, công nghiệp và môi trường. Tuy còn một số hạn chế, ELISA đang được cải tiến nhằm khắc phục và nâng cao hiệu suất. Các công cụ ELISA tối ưu hơn mở ra nhiều cơ hội mới trong chẩn đoán bệnh, nghiên cứu y học, sản xuất và phát triển dược phẩm.