Giải trình tự tế bào đơn

Giải trình tự tế bào đơn là gì?

Phần lớn các tế bào trong cơ thể đều có cùng bộ gen nhưng biểu hiện gen trong mỗi tế bào có thể khác nhau tùy vào chức năng, trạng thái và môi trường vi mô xung quanh chúng. Trong khi các phương pháp giải trình tự truyền thống chỉ cung cấp thông tin tổng thể về hoạt động của cả khối mô hoặc một nhóm tế bào, giải trình tự tế bào đơn (single-cell sequencing) là kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại có thể phân tích biểu hiện gen của từng tế bào riêng lẻ.

Giải trình tự tế bào đơn được dùng cho các mục đích sau:

• Phân loại tế bào trong mẫu mô phức tạp
• Phát hiện các quần thể tế bào hiếm nhưng có vai trò sinh học quan trọng
• Tìm hiểu khác biệt di truyền giữa những tế bào cùng loại

Công nghệ này thường được sử dụng trong các nghiên cứu phân tích bộ gen (genomics), bộ phiên mã (transcriptomics) và biến đổi di truyền biểu sinh (epigenomics). Tuy nhiên, đây không phải là phương pháp tối ưu cho các nghiên cứu về biểu hiện protein, thay vào đó người ta thường sử dụng công nghệ khối phổ hoặc dòng chảy tế bào.

Bảng: Các công nghệ giải trình tự tế bào đơn

Công nghệ	Mục tiêu phát hiện	Ứng dụng
Giải trình tự bộ gen tế bào đơn	Đột biến điểm, đa hình nucleotide đơn, thay đổi số lượng bản sao gen	Phát hiện đột biến de novo trong tế bào trứng và tinh trùng, đột biến gây ung thư, bệnh thoái hoá thần kinh
Giải trình tự bộ phiên mã tế bào đơn	Khác biệt về biểu hiện gen vào giai đoạn phiên mã giữa các tế bào	Nghiên cứu quá trình biến đổi của khối u, phản ứng của khối u với thuốc hoá trị các thay đổi về biểu hiện gen dẫn đến kháng thuốc
Giải trình tự bộ di truyền biểu sinh tế bào đơn	Methyl hoá ADN, biến đổi histone trên chất nhiễm sắc	Nghiên cứu các giai đoạn phát triển và biệt hoá tế bào, phát hiện biến đổi di truyền biểu sinh liên quan đến cơ chế kháng thuốc trị ung thư

Quy trình thực hiện

Quy trình giải trình tự tế bào đơn có thể thay đổi tuỳ vào mục tiêu phân tích, bao gồm các bước cơ bản như sau:

Bước 1: Xử lý mẫu

Mẫu mô thu nhận từ người bệnh được xử lý bằng phương pháp cơ học, enzyme hoặc kết hợp nhằm phá vỡ cấu trúc mô. Trong phương pháp cơ học, người ta cắt, nghiền, hoặc hút nhả mẫu liên tục. Mặt khác, một số enzyme như collagenase, trypsin, dispase, elastase,… được dùng để phân cắt các liên kết protein trong mô. Ngoài ra, phương pháp cơ học và enzyme có thể được kết hợp cùng lúc hoặc lần lượt cùng với các hệ thống tự động nhằm tăng hiệu quả phá mô.

Tiếp theo, người ta có thể loại bỏ tế bào chết khỏi mẫu cũng như chọn lọc những loại tế bào cần nghiên cứu dựa trên kích thước, hình dạng, mật độ tế bào hoặc liên kết đặc hiệu giữa kháng thể có gắn chất phát huỳnh quang, hạt từ với kháng nguyên của tế bào mục tiêu.

Bước 2: Phân lập tế bào và khuếch đại trình tự

Các kỹ thuật phân lập tế bào được phân loại dựa trên hiệu suất.

Một số phương pháp phân lập hiệu suất thấp bao gồm:

Kĩ thuật	Mô tả	Ưu điểm	Nhược điểm
Pha loãng	Pha loãng dung dịch chứa mẫu đến khi chỉ còn 1 tế bào	Đơn giản Không cần thiết bị chuyên dụng	Tốn thời gian Có nguy cơ mẫu còn chứa nhiều tế bào
Hút nhả	Sử dụng dụng cụ hút nhả (pipette)	Không cần thiết bị chuyên dụng	Kỹ thuật khó, thao tác không đồng nhất
Tự động	Dùng hệ thống pipette nhỏ do robot điều khiển	Kiểm soát vị trí tế bào sau khi phân lập	Cần thiết bị chuyên dụng
Laser	Phân cắt từng tế bào trong mẫu bằng tia laser	Giữ nguyên vị trí tế bào trong mẫu	Kỹ thuật khó, gây đứt gãy ADN và ARN
Dòng chảy	Phân lập các vi giọt chứa tế bào đơn bằng điện tích	Có thể lựa chọn chính xác các loại tế bào theo kích thước, hình dạng, độ phức tạp, biểu hiện protein	Cần thiết bị đắt tiền và chuyên dụng, tế bào tiếp xúc với áp suất cao

Các kĩ thuật phân lập tế bào hiệu suất cao bao gồm:

Kỹ thuật	Mô tả	Ưu điểm	Nhược điểm
Vi mạch dòng chảy	Phân lập tế bào qua các kênh dòng chảy nhỏ	Độ nhạy cao, phù hợp với thể tích nhỏ, linh hoạt	Các tế bào phải có kích thước đồng đều, tốn nhiều chi phí
Vi giọt	Phân tách tế bào trong các giọt nhỏ, sau đó ly giải và thu nhận ADN/ARN mục tiêu	Có thể sử dụng mã định danh phân tử hoặc mã vạch tế bào nhằm nhận diện tế bào và gen đặc hiệu, chi phí thấp, có nhiều sản phẩm thương mại	Kỹ thuật khó, cần thiết bị chuyên dụng
Giếng nhỏ	Bắt giữ tế bào đơn trong các giếng có kích thước siêu nhỏ	Hỗ trợ chụp ảnh và nuôi cấy tế bào ngắn hạn	Ứng dụng thương mại còn hạn chế
Chỉ số tổ hợp	Gắn mã vạch cho nhân tế bào bằng enzyme transposase	Chi phí thấp, phù hợp với các phương pháp phân tích đa phân tử (multiomic)	Ứng dụng thương mại còn hạn chế

Các tế bào sau khi phân lập được xử lí với hoá chất nhằm phá vỡ cấu trúc tế bào, từ đó ADN, ARN hoặc protein được thu nhận. Các trình tự này được phân cắt thành nhiều đoạn nhỏ, sau đó khuếch đại để tăng số lượng bản sao nhằm chuẩn bị cho bước giải trình tự. Đối với ARN, người ta cần chuyển trình tự ARN thành mạch ADN bổ sung được gọi là cADN thông qua phản ứng phiên mã ngược với enzyme reverse transcriptase trước khi khuếch đại.

Bước 3: Giải trình tự

Sau các bước phân lập tế bào sống đơn, thu nhận vật liệu di truyền cần phân tích và khuếch đại, người ta tiến hành giải trình tự. Hiện nay, có nhiều công nghệ giải trình tự phù hợp với các phương pháp phân lập, khuếch đại và mục tiêu cần phân tích khác nhau.

Bước 4: Phân tích dữ liệu

Quá trình xử lý kết quả giải trình tự bao gồm 3 giai đoạn chính. Đầu tiên, tín hiệu thô thu được từ máy giải trình tự được chuyển đổi thành chuỗi các nucleotide (A, T, G, C). Sau đó, người ta phân loại trình tự thuộc các mẫu khác nhau, so sánh chúng với trình tự tham chiếu trên các cơ sở dữ liệu nhằm xác định vị trí trình tự trong bộ gen. Đồng thời, người ta phân tích một số đặc điểm di truyền cơ bản như mức độ biểu hiện gen, đột biến, thay đổi số bản sao gen. Cuối cùng, dữ liệu được tổng hợp và biểu diễn dưới dạng biểu đồ, qua đó người ta có thể nghiên cứu nhằm tìm ra những thông tin sinh học mới.

Ứng dụng

Ung thư

Người ta đã ghi nhận nhiều biến đổi di truyền trong mô khối u có liên quan đến quá trình hình thành và di căn ung thư.

Công nghệ giải trình tự tế bào đơn được ứng dụng trong lĩnh vực này nhằm:

• Tạo sơ đồ tế bào trong mô ung thư và môi trường vi khối u
• Phân loại các nhóm tế bào cụ thể trong khối u
• Xác định dấu ấn sinh học của bệnh ung thư
• Nghiên cứu cơ chế hình thành và di căn ung thư

Thần kinh

Trong hệ thần kinh, một số tế bào có số lượng bản sao gen khác nhau gây khó khăn cho các nghiên cứu về hoạt động của não. Tuy nhiên, người ta đã có thể phân loại và lập bản đồ chi tiết của từng loại tế bào thần kinh cũng như những phân tử kết nối trong não nhờ vào kỹ thuật giải trình tự tế bào đơn. Công nghệ này là một trong những yếu tố thúc đẩy các nghiên cứu về quá trình phát triển não, thần kinh học và bệnh lí thần kinh.

Sinh sản

Công nghệ giải trình tự tế bào đơn có thể phân tích, định lượng toàn bộ hệ gen của tế bào sinh dục và tế bào phôi tại cấp độ đơn bào, qua đó hỗ trợ các nghiên cứu về cơ chế hình thành tế bào sinh dục cũng như sàng lọc, chẩn đoán và điều trị các bệnh lý liên quan đến sinh sản như vô sinh nam. Ngoài ra, công nghệ này còn được ứng dụng trong hỗ trợ sinh sản nhằm lựa chọn tế bào trứng hoặc phôi khỏe mạnh để giảm nguy cơ sinh con mắc bệnh di truyền bẩm sinh. Trong lĩnh vực nghiên cứu phôi, người ta còn sử dụng giải trình tự tế bào đơn nhằm phát hiện các loại tế bào miễn dịch và cơ chế điều hòa giúp hạn chế phản ứng miễn dịch từ mẹ, qua đó tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình hình thành, phát triển của phôi thai.

Miễn dịch

Công nghệ giải trình tự tế bào đơn được ứng dụng để nghiên cứu hoạt đông của hệ miễn dịch thông qua phát hiện và phân loại các loại tế bào miễn dịch. Cụ thể, người ta đã phân loại các tế bào giết tự nhiên, tế bào tua và tế bào lympho thành nhiều nhóm nhỏ với những vai trò cụ thể. Ngoài ra, giải trình tự tế bào đơn còn được sử dụng để nghiên cứu nguyên nhân dẫn đến tính dị biệt của tế bào miễn dịch.

Tiêu hoá và tiết niệu

Trong hệ tiêu hóa, người ta đã phát hiện nhiều phân nhóm mới của tế bào biểu mô ruột thông qua giải trình tự tế bào đơn, đồng thời xây dựng bản đồ biểu hiện gen chi tiết của các tế bào này, từ đó giải thích cơ chế duy trì cân bằng nội môi và phản ứng với vi sinh vật gây bệnh lí đường ruột. Đối với hệ tiết niệu, người ta ghi nhận các con đường điều hòa phiên mã và tín hiệu liên quan đến quá trình biệt hóa tế bào biểu mô ống thận cũng như xác định biểu hiện của một số gen liên quan đến bệnh thận bẩm sinh.

Lợi ích và thách thức

Công nghệ giải trình tự tế bào đơn giữ vai trò quan trọng đối với khoa học sự sống và y học hiện đại nhờ vào khả năng phân tích khác biệt di truyền giữa mỗi tế bào, kể cả những tế bào cùng loại. Tuy nhiên, công nghệ này vẫn còn nhiều hạn chế về kỹ thuật như giai đoạn phân lập tế bào có thể làm tổn hại đến tính toàn vẹn và hoạt động của tế bào. Ngoài ra, công nghệ này chưa thể phân biệt chi tiết khác biệt giữa các tế bào trong quá trình biệt hóa và phân chia. Bên cạnh đó, chi phí cao cũng là một rào cản đáng kể.

Lời kết

Giải trình tự tế bào đơn đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về khối u, hệ thần kinh, y học sinh sản, miễn dịch học,… Công nghệ này phân tích các tế bào riêng lẻ có tính dị biệt cao, từ đó cung cấp các thông tin mới về quá trình sinh lý của tế bào và cơ chế gây bệnh, góp phần phát triển các phương pháp chẩn đoán mới và xác định những mục tiêu điều trị tiềm năng.