Kĩ thuật biểu hiện phage (Phage display)

Giới thiệu

Trong lĩnh vực y học và sinh học, các nhà khoa học thường cần tìm kiếm những phân tử có khả năng liên kết một cách đặc hiệu với các mục tiêu sinh học cụ thể. Các mục tiêu này có thể là protein trên bề mặt tế bào ung thư, virus gây bệnh hoặc các phân tử khác liên quan đến bệnh tật. Tìm ra những phân tử liên kết đặc hiệu này là rất quan trọng để phát triển các phương pháp chẩn đoán bệnh chính xác, các loại thuốc điều trị hiệu quả và nghiên cứu sinh học cơ bản. Tuy nhiên, tìm kiếm phân tử liên kết phù hợp trong số hàng tỉ phân tử tiềm năng là nhiệm vụ rất khó khăn. Quá trình này có thể tốn nhiều thời gian, chi phí cao và không phải lúc nào cũng mang lại kết quả mong muốn.

Nhu cầu về phương pháp cho phép sàng lọc lượng lớn các phân tử một cách nhanh chóng, hiệu quả và có độ chính xác cao đã thúc đẩy sự phát triển của một công nghệ quan trọng là liệu pháp biểu hiện phage (phage display). Công nghệ này cung cấp công cụ mạnh mẽ để khám phá các phân tử sinh học, chủ yếu trong phát triển các loại thuốc mới và các kháng thể.

Phage display là gì?

Phage display là kĩ thuật sinh học phân tử cho phép một protein, một đoạn peptide (chuỗi ngắn các axit amin) hoặc một kháng thể (protein của hệ miễn dịch) được hiển thị trên bề mặt bên ngoài của virus. Loại virus này được gọi là thực khuẩn thể (bacteriophage hoặc phage), nó chỉ lây nhiễm và nhân lên bên trong vi khuẩn, không lây nhiễm sang tế bào người hay động vật.

Điểm đáng chú ý của phage display là vật chất di truyền (ADN) mã hóa cho protein hoặc peptide được hiển thị trên bề mặt virus vẫn nằm bên trong chính virus đó. Điều này tạo ra liên kết trực tiếp giữa thông tin di truyền (kiểu gen) và đặc điểm bên ngoài có thể quan sát được (kiểu hình). Nói cách khác, mỗi thực khuẩn thể mang trên bề mặt protein hoặc peptide cụ thể và đồng thời chứa bên trong gen của chính protein hoặc peptide đó.

Người ta thường tạo ra bộ sưu tập rất lớn các thực khuẩn thể chứa những đoạn ADN khác nhau, do đó chúng mang nhiều protein bề mặt khác nhau. Bộ sưu tập này được gọi là thư viện biểu hiện phage.

Khi tiếp xúc với protein mục tiêu, chẳng hạn như protein gây bệnh, các thực khuẩn thể có protein bề mặt phù hợp và có khả năng liên kết mạnh với mục tiêu bám vào. Những thực khuẩn thể không liên kết hoặc liên kết yếu bị rửa trôi. Sau đó, các thực khuẩn thể đã liên kết được thu thập. ADN bên trong chúng được tách ra và phân tích trình tự. Kết quả phân tích trình tự ADN cho phép các nhà khoa học xác định chính xác cấu trúc của protein bề mặt đã liên kết thành công với mục tiêu. Phương pháp sàng lọc này đạt hiệu quả cao, nó có thể tìm ra các phân tử liên kết mục tiêu mong muốn từ lượng lớn các ứng viên tiềm năng mà không cần phải thử từng phân tử một.

Lịch sử phát triển

Công nghệ Phage Display ra đời từ những nghiên cứu đột phá của hai nhà khoa học xuất sắc. Năm 1985, George P. Smith tại Đại học Missouri đã đặt nền móng cho công nghệ này. Smith phát triển phương pháp hiển thị các peptide (chuỗi axit amin ngắn) trên bề mặt thực khuẩn thể bằng cách chèn gen mã hóa peptide mong muốn vào gen protein vỏ của virus. Khi thực khuẩn thể hình thành, peptide sẽ xuất hiện trên bề mặt, chúng tạo ra mối liên kết trực tiếp giữa đặc điểm bên ngoài và thông tin di truyền bên trong virus.

Sir Gregory P. Winter tại Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử MRC, Cambridge đã mở rộng ứng dụng công nghệ này. Winter nhận ra tiềm năng to lớn của Phage Display trong tạo ra kháng thể mới, ông đã sử dụng công nghệ để phát triển các kháng thể có khả năng liên kết hiệu quả với mục tiêu cụ thể. Đóng góp quan trọng nhất của ông là tạo ra kháng thể hoàn toàn từ người, phản ứng miễn dịch được giảm thiểu khi sử dụng làm thuốc điều trị.

Những đóng góp khoa học của Smith và Winter đã được vinh danh bằng giải Nobel Hóa học năm 2018. Công trình của họ đã cách mạng hóa ngành phát triển thuốc, nhất là thuốc dựa trên kháng thể, từ đó mang lại lợi ích to lớn cho điều trị bệnh tự miễn và ung thư.

Nguyên lí và qui trình hoạt động

Phage display hoạt động dựa trên một số nguyên lí sinh học cơ bản liên quan đến thực khuẩn thể và cách chúng tương tác với vi khuẩn.

Liên kết kiểu gen và kiểu hình

Nguyên lí chính của Phage Display dựa trên tạo ra mối liên hệ trực tiếp và bất biến giữa kiểu gen và kiểu hình. Kiểu gen là thông tin di truyền (ADN) mã hóa cho protein hoặc peptide cụ thể, trong khi kiểu hình là protein hoặc peptide được hiển thị trên bề mặt thực khuẩn thể.

Đoạn gen mã hóa protein mong muốn được chèn vào genome của thực khuẩn thể. Gen này được ghép nối với gen mã hóa protein vỏ của virus nhằm tạo ra gen lai. Khi thực khuẩn thể nhân bản, gen lai tạo thành vỏ virus có gắn thêm protein hoặc peptide mong muốn.

Kết quả là mỗi hạt thực khuẩn thể sẽ hiển thị protein đặc trưng trên bề mặt và đồng thời chứa bên trong chính đoạn ADN mã hóa cho protein đó. Mối liên hệ này đảm bảo rằng khi tìm thấy thực khuẩn thể có protein liên kết tốt với mục tiêu, các nhà khoa học có thể ngay lập tức xác định trình tự gen tương ứng bằng cách phân tích ADN bên trong virus đó.

Áp lực chọn lọc

Quá trình biểu hiện Phage mô phỏng cơ chế chọn lọc tự nhiên. Khi một tập hợp lớn các thực khuẩn thể mang protein bề mặt khác nhau được cho tiếp xúc với mục tiêu cố định, chỉ những thực khuẩn thể có protein bề mặt liên kết mạnh mẽ với mục tiêu mới có thể bám vào. Các thực khuẩn thể không liên kết hoặc liên kết yếu sẽ bị loại bỏ thông qua quá trình rửa.

Quá trình này lặp lại 3–5 lần. Sau mỗi vòng, số lượng thực khuẩn thể có khả năng liên kết tốt tăng lên, trong khi những con liên kết kém dần bị loại bỏ. Cuối cùng, thư viện chỉ còn lại những thực khuẩn thể có protein liên kết mạnh nhất với mục tiêu.

Đa dạng thư viện

Thành công của Phage display phụ thuộc rất nhiều vào sự đa dạng của thư viện thực khuẩn thể. Thư viện càng lớn và chứa càng nhiều biến thể protein hoặc peptide khác nhau, khả năng tìm thấy các phân tử có ái lực cao và đặc hiệu với mục tiêu càng tăng. Các thư viện này có thể được tạo ra từ các nguồn tự nhiên (ví dụ: từ các tế bào miễn dịch của động vật) hoặc được tổng hợp trong phòng thí nghiệm.

Qui trình thực hiện

Qui trình hoạt động của Phage display thường được gọi là biopanning. Nó là chuỗi các bước lặp lại để chọn lọc và làm giàu các thực khuẩn thể mang protein liên kết mục tiêu.

Xây dựng thư viện

Bước đầu tiên là tạo ra thư viện thực khuẩn thể rất lớn. Mỗi thực khuẩn thể trong thư viện này được thiết kế để hiển thị một peptide hoặc protein khác nhau trên bề mặt. Sự đa dạng của thư viện là yếu tố quan trọng nhất nhằm đảm bảo rằng có đủ các biến thể để tìm ra phân tử liên kết mục tiêu.

Sàng lọc (Panning)

Thư viện thực khuẩn thể được cho tiếp xúc với mục tiêu đã được cố định trên bề mặt rắn (đĩa nhựa hoặc các hạt từ tính). Các thực khuẩn thể mang protein có khả năng liên kết với mục tiêu sẽ bám vào bề mặt này. Các thực khuẩn thể không liên kết bị loại bỏ tại bước rửa.

Rửa giải (Elution)

Sau khi rửa sạch các thực khuẩn thể không liên kết, các thực khuẩn thể đã bám dính được tách ra khỏi phân tử mục tiêu. Trong bước này, người ta thường thay đổi các điều kiện hóa học (chẳng hạn như thay đổi độ pH) hoặc sử dụng phân tử khác có khả năng cạnh tranh liên kết với mục tiêu.

Khuếch đại (Amplification)

Các thực khuẩn thể đã được rửa giải được cho lây nhiễm vào vi khuẩn E. coli. Vi khuẩn này sau đó nhân lên, đồng thời tạo ra lượng lớn các bản sao của các thực khuẩn thể đã được chọn lọc. Trong bước này, số lượng các thực khuẩn thể có ái lực cao được tăng lên nhằm chuẩn bị cho các vòng sàng lọc tiếp theo.

Lặp lại

Các bước sàng lọc, rửa giải và khuếch đại được lặp lại nhiều lần, thường là từ 3 đến 5 vòng. Mỗi vòng lặp làm tăng tỉ lệ các thực khuẩn thể có ái lực cao nhất trong thư viện, dần dần tinh chỉnh tập hợp các thực khuẩn thể để chỉ còn lại những phân tử liên kết mục tiêu mạnh mẽ và đặc hiệu nhất.

Sau khi hoàn thành nhiều vòng biopanning, các dòng thực khuẩn thể riêng lẻ được phân lập. ADN của chúng được giải trình tự nhằm xác định chính xác trình tự của peptide hoặc protein được hiển thị. Đồng thời, các xét nghiệm được thực hiện để đánh giá ái lực và độ đặc hiệu của chúng.

Ứng dụng của Phage display

Công nghệ Phage display là công cụ linh hoạt và mạnh mẽ với nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực y học, sinh học và công nghệ sinh học.

Phát triển kháng thể đơn dòng

Đây là một trong những ứng dụng quan trọng nhất của Phage display. Kháng thể đơn dòng là các protein được tạo ra bởi hệ miễn dịch, chúng có khả năng liên kết rất đặc hiệu với mục tiêu duy nhất (kháng nguyên). Các kháng thể đơn dòng được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán và điều trị nhiều loại bệnh, bao gồm ung thư, bệnh tự miễn và các bệnh truyền nhiễm. Phage display cho phép tạo ra các thư viện kháng thể rất lớn, sau đó sàng lọc để tìm ra những kháng thể có khả năng liên kết mạnh mẽ với các kháng nguyên gây bệnh.

Adalimumab (tên thương mại Humira) là ví dụ tiêu biểu cho thành công của công nghệ này trong sản xuất kháng thể đơn dòng. Đây là thuốc kháng thể hoàn toàn từ người đầu tiên được tạo ra bằng Phage display. Loại thuốc này được phê duyệt năm 2002 trong điều trị viêm khớp dạng thấp và nhiều bệnh tự miễn khác.

Khám phá và phát triển thuốc

Phage display là công cụ hiệu quả để tìm kiếm các ứng viên thuốc tiềm năng. Phương pháp này có thể được sử dụng để xác định các peptide hoặc protein có khả năng ức chế hoạt động của những protein gây bệnh hoặc tương tác với các thụ thể trên bề mặt tế bào để điều hòa các quá trình sinh học. Từ đây, các nhà khoa học có thể tìm ra những phân tử khởi đầu cho phát triển các loại thuốc mới, chủ yếu là các loại thuốc sinh học.

Nghiên cứu tương tác protein-protein

Khi hiểu rõ cách các protein tương tác với nhau, người ta có thể làm sáng tỏ những đường truyền tín hiệu trong tế bào và cơ chế phát triển của bệnh. Phage display là phương pháp hiệu quả để xác định các đối tác tương tác của protein cụ thể, từ đây người ta có thể xây dựng bản đồ các tương tác protein và khám phá các mục tiêu mới trong điều trị bệnh.

Phát triển vắc-xin

Trong lĩnh vực vắc-xin, Phage display có thể được sử dụng để xác định các kháng nguyên tiềm năng. Bằng cách hiển thị các đoạn protein hoặc peptide từ các tác nhân gây bệnh (như virus, vi khuẩn) trên bề mặt thực khuẩn thể, các nhà nghiên cứu có thể sàng lọc để tìm ra những kháng nguyên gây ra phản ứng miễn dịch mạnh mẽ nhất, từ đó phát triển các loại vắc-xin hiệu quả hơn.

Chẩn đoán

Phage Display cũng được ứng dụng để phát triển các công cụ chẩn đoán bệnh. Những peptide hoặc kháng thể được chọn lọc thông qua phage dislay có thể được sử dụng để phát hiện các dấu ấn sinh học của bệnh trong các mẫu sinh học như máu hoặc nước tiểu. Do đó, bệnh nhân có thể được chẩn đoán bệnh sớm và chính xác, cũng như theo dõi hiệu quả của quá trình điều trị.

Kĩ thuật protein

Công nghệ này cho phép các nhà khoa học tạo ra các protein với các đặc tính mới hoặc cải thiện các đặc tính hiện có. Bằng cách tạo ra các thư viện chứa nhiều biến thể protein và sàng lọc chúng, người ta có thể chọn ra các protein có ái lực liên kết và độ ổn định cao hoặc hoạt tính xúc tác mạnh hơn. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong phát triển các enzyme dùng trong công nghiệp, các protein dùng làm thuốc điều trị và các công cụ sinh học khác.

Lời kết

Phage display là một trong những công cụ sinh học có tính ứng dụng cao nhất, tạo ra những thay đổi sâu sắc trong lĩnh vực sinh học phân tử và y sinh học. Công nghệ này không những giúp khám phá các phân tử có khả năng liên kết với mục tiêu cụ thể mà còn mở ra con đường phát triển các loại thuốc kháng thể mới với hiệu quả vượt trội.

Phage display có khả năng sàng lọc các thư viện phân tử khổng lồ và tạo ra mối liên hệ trực tiếp giữa thông tin di truyền và tính năng biểu hiện. Nhờ đó, công nghệ này giải quyết được nhiều vấn đề khoa học phức tạp mà các phương pháp truyền thống không thể tiếp cận. Hơn nữa, Phage display có tiềm năng hỗ trợ phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị hiệu quả hơn cho nhiều bệnh lí nghiêm trọng. Với những tiến bộ không ngừng của khoa học, Phage display hứa hẹn sẽ tiếp tục mang lại những đột phá quan trọng trong nghiên cứu và ứng dụng y sinh học.