Xét nghiệm lai huỳnh quang tại chỗ FISH

Giới thiệu

Xét nghiệm lai huỳnh quang tại chỗ (Fluorescence In Situ Hybridization – FISH) là kĩ thuật đánh dấu nhiễm sắc thể hoặc gen mục tiêu bằng đầu dò gắn chất phát huỳnh quang.

Hiện nay, FISH được dùng cho các mục đích sau:

• Sàng lọc đột biến gen gây ung thư
• Xét nghiệm di truyền tiền làm tổ trước và sau khi sinh
• Lập bản đồ gen
• So sánh vị trí gen giữa các loài gần nhau

Nguyên lí hoạt động

ADN là vật chất di truyền có dạng xoắn kép. Hai mạch ADN chứa các cặp nucleotide có trình tự bổ sung và liên kết với nhau.

Xét nghiệm lai huỳnh quang tại chỗ hoạt động dựa trên liên kết này giữa ADN của bệnh nhân với đầu dò. Người ta thiết kế đầu dò chứa trình tự đặc hiệu cho đoạn ADN cần phát hiện, đồng thời bổ sung chất phát huỳnh quang làm tín hiệu nhằm biết được mức độ hiện diện của đoạn ADN mục tiêu khi chúng gắn vào đầu dò.

Các loại đầu dò

Ba loại đầu dò được phát triển cho các ứng dụng khác nhau.

Đầu dò đoạn gen

Đầu dò đặc hiệu cho đoạn gen mục tiêu có thể xác định vị trí các gen trên nhiễm sắc thể cũng như số lượng bản sao của gen. Đầu dò này có thể phát hiện đột biến mất đoạn nhỏ nên chúng được sử dụng để thay thế các phương pháp nhuộm nhiễm sắc thể thông thường.

Đầu dò vùng trình tự lặp lại

Một số vị trí trên nhiễm sắc thể như telomere tại đầu mút và tâm động tại giữa nhiễm sắc thể chứa nhiều đoạn trình tự lặp lại. Đầu dò tâm động cho biết số lượng nhiễm sắc thể trong nhân tại kì giữa. Đầu dò telomere và cận telomere phát hiện đột biến chuyển đoạn nhỏ tại vùng đầu nhiễm sắc thể. Người ta có thể kết hợp các đầu dò này với đầu dò đoạn gen nhằm phát hiện đột biến mất đoạn.

Ảnh: Quá trình phân chia tế bào
Nguồn: Designua/Shutterstock.com

Đầu dò nhiễm sắc thể

Dạng đầu dò nhiễm sắc thể gồm nhiều đầu dò nhỏ liên kết với các đoạn trình tự khác nhau trên nhiễm sắc thể. Đầu dò đặc hiệu cho từng nhiễm sắc thể gắn với một loại màu huỳnh quang khác nhau. Kết quả lai có thể phát hiện các bất thường trên nhiễm sắc thể như chuyển đoạn, thừa đoạn nhỏ hay nhiễm sắc thể vòng (nhiễm sắc thể đứt gãy tại hai vị trí trên nhánh ngắn và nhánh dài, sau đó đầu bị đứt kết hợp với nhau).

Ứng dụng

Kĩ thuật FISH được ứng dụng để phát hiện những bất thường về số lượng và cấu trúc nhiễm sắc thể.

Một số dạng đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể bao gồm:

• Lặp đoạn : kết quả FISH cho thấy gen mục tiêu có nhiều hơn hai bản sao
• Chuyển đoạn : kĩ thuật viên sử dụng đầu dò đặc hiệu cho một gen nhưng gắn với hai loại chất nhuộm huỳnh quang, kết quả FISH cho thấy hai bản sao của một gen không xếp cạnh nhau
• Mất đoạn: đầu dò không liên kết với đoạn ADN mục tiêu nên không phát tín hiệu huỳnh quang

Ảnh: Lặp đoạn nhiễm sắc thể
Nguồn: U.S. National Library of Medicine

Ảnh: Chuyển đoạn cân bằng
Nguồn: U.S. National Library of Medicine

FISH có thể xác định đột biến gen, do đó kĩ thuật này được sử dụng để chẩn đoán những bệnh như:

• Ung thư hạch bạch huyết
• Bệnh bạch cầu dòng tủy cấp tính, mãn tính và các dạng khác
• Đa u tuỷ
• Ung thư bàng quang
• U thần kinh đệm
• U trung biểu mô
• Lặp đoạn gen HER2 trong ung thư vú, ung thư dạ dày, ung thư phổi
• Lặp đoạn gen MET trong ung thư phổi, ung thư dạ dày, ung thư thực quản
• Lặp đoạn gen MYCN trong u nguyên bào thần kinh
• Chuyển đoạn hoặc dung hợp gen ALK, RET, ROS1 trong ung thư phổi không tế bào nhỏ

Bên cạnh đầu dò ADN, người ta còn thiết kế các loại đầu dò có khả năng phát hiện ARN nhằm so sánh quá trình biểu hiện gen, biến đổi và vận chuyển ARN thông tin giữa tế bào bình thường với tế bào đột biến.

Quy trình thực hiện

Chuẩn bị mẫu

Bác sĩ chỉ định các phương pháp thu mẫu khác nhau tuỳ vào mục đích xét nghiệm, cụ thể như sau:

• Xét nghiệm tiền sản: chọc ối
• Xét nghiệm tiền làm tổ: lấy một lượng nhỏ tế bào từ phôi
• Chẩn đoán bất thường nhiễm sắc thể hoặc đột biến gen: thu máu
• Chẩn đoán ung thư, phát hiện đột biến gen trong tế bào khối u: sinh thiết khối u hoặc tuỷ
• Theo dõi ung thư bàng quang: thu mẫu nước tiểu

Sau khi thu mẫu, kĩ thuật viên tách chiết và nuôi cấy tế bào từ mẫu máu, mô, nước tiểu hoặc khối u của bệnh nhân trong phòng thí nghiệm. Khi tế bào tiến vào kì giữa, người ta sẽ ngừng nuôi cấy. Kì giữa là thời điểm nhiễm sắc thể có mức độ co xoắn cao và xếp thành một hàng nên có thể dễ dàng quan sát được bằng kính hiển vi. Lúc này, nhiễm sắc thể được cố định trên bề mặt lam kính. Quy trình này được gọi là FISH kì giữa.

Đối với trường hợp tế bào ung thư được cố định trong khối paraffin bằng formalin, người ta thực hiện kĩ thuật FISH kì trung gian thay vì nuôi cấy đến kì giữa.

Ảnh: Sinh thiết phôi nang
Nguồn: invitra.com

Ảnh: Chọc hút và sinh thiết tủy xương
Nguồn: Terese Winslow

Lai huỳnh quang tại chỗ

Các bước thực hiện xét nghiệm lai huỳnh quang tại chỗ bao gồm.

Bước 1. Thiết kế đầu dò

Người ta thiết kế đầu dò đặc hiệu cho đoạn trình tự mục tiêu và chèn phân tử phát huỳnh quang tại nhiều vị trí trên đầu dò. Sau đó, các đầu dò này được đặt trên lam kính chứa mẫu.

Bước 2. Tách mạch ADN và đầu dò

Mẫu ADN thu nhận từ bệnh nhân và đầu dò đều có dạng mạch đôi nên không thể liên kết với nhau. Người ta sử dụng nhiệt độ cao để tách mạch đôi thành mạch đơn.

Bước 3. Lai hoá

Sau bước tách mạch, nhiệt độ giảm xuống giúp đầu dò liên kết với trình tự mục tiêu trên nhiễm sắc thể. Những đoạn đầu dò không liên kết hoặc liên kết lỏng lẻo với vùng không đặc hiệu được rửa trôi.

Bước 4. Quan sát kính hiển vi

Cuối cùng, kĩ thuật viên quan sát lam kính bằng kính hiển vi huỳnh quang và xác định các vùng nhiễm sắc thể phát tín hiệu huỳnh quang.

Nhận kết quả

Bệnh nhân có thể nhận kết quả xét nghiệm sau 1–4 tuần. Kết quả dương tính nghĩa là người bệnh mang đột biến gen hoặc nhiễm sắc thể. Bác sĩ sẽ giải thích kết quả cho bệnh nhân và đề ra các phương án điều trị nếu có.

Ưu điểm

Kĩ thuật FISH mang lại nhiều lợi ích bao gồm:

• Hỗ trợ giải thích kết quả nhiễm sắc thể đồ và xét nghiệm microarray
• Cung cấp thông tin về vị trí nhiễm sắc thể (FISH kì giữa)
• Xác định các trường hợp dung hợp, lặp đoạn, mất đoạn trong khối u (FISH kì trung gian)
• Phát hiện đột biến số lượng nhiễm sắc thể, đột biến khảm
• Có thể rút ngắn thời gian xét nghiệm trong trường hợp khẩn cấp
• Nhiều đầu dò phù hợp cho phần lớn các vùng trên bộ gen

Ảnh: Đột biến thể khảm
Nguồn: National Cancer Institute

Hạn chế

Tuy nhiên, kĩ thuật này có một số hạn chế như:

• Giới hạn số loại đầu dò trong một xét nghiệm
• Cần nuôi cấy tế bào đối với FISH kì giữa
• FISH kì trung gian không cho biết vị trí nhiễm sắc thể
• Cần người có chuyển môn để giải thích kết quả ảnh chụp FISH
• Phát hiện đột biến lặp đoạn nhỏ kém nhạy hơn mất đoạn nhỏ
• Không phát hiện trường hợp di truyền đơn gen (hai nhiễm sắc thể đều có nguồn gốc từ bố hoặc mẹ)
• Không xác định đột biến chuyển đoạn không điển hình
• Tín hiệu huỳnh quang trùng nhau do các nhiễm sắc thể xếp chồng
• Liên kết không đặc hiệu làm ảnh hưởng đến kết quả

Lời kết

Xét nghiệm lai huỳnh quang tại chỗ sử dụng đầu dò có khả năng liên kết với đoạn gen mục tiêu. Đầu dò này gắn chất phát huỳnh quang giúp phát hiện đoạn ADN mục tiêu hiện diện trong mẫu. Hiện nay, người ta đã phát triển ba dạng đầu dò đặc hiệu cho đoạn gen, vùng trình tự lặp lại và toàn bộ nhiễm sắc thể. Kĩ thuật này được ứng dụng cho nhiều mục đích khác nhau như xác định đột biến gen gây ung thư hay chẩn đoán bệnh do bất thường nhiễm sắc thể gây ra.