ARN không mã hoá: Mục tiêu mới trong điều trị ung thư

ARN không mã hoá là gì?

Gen cung cấp hướng dẫn tạo ra protein thông qua phân tử trung gian là ARN thông tin (mRNA) hay còn gọi là ARN mã hoá. Tuy nhiên, phần lớn ARN trong cơ thể là những ARN không mã hoá (non-coding RNA – ncRNA). Những phân tử này không trực tiếp tham gia vào quá trình tổng hợp protein nhưng chúng giữ nhiều vai trò quan trọng đối với các cơ chế điều hoà biểu hiện gen, tăng sinh, biệt hoá và chết tế bào.

ncRNA được phân loại thành hai nhóm chính dựa trên kích thước của chúng như sau:

• NcRNA mạch ngắn (<200 nucleotide): miRNA, siRNA, PIWI-interacting RNA,...
• NcRNA mạch dài (>200 nucleotide): incRNAs, circRNAs,…

ncRNA điều hoà biểu hiện gen thông những tương tác với ADN, ARN và protein như:

• Thu hút các phức hợp tái cấu trúc chất nhiễm sắc nhằm điều hoà biến đổi di truyền biểu sinh
• Liên kết với trình tự điều hoà trên ADN nhằm ức chế, làm tăng hoặc giảm mức độ phiên mã
• Phân cắt, vận chuyển, phân giải mRNA nhằm kiểm soát hoạt động dịch mã

Người ta đã ghi nhận nhiều bệnh lí, đặc biệt là ung thư, liên quan đến những bất thường trong cấu trúc và chức năng của ncRNA.

Vai trò của các ncRNA trong ung thư

ncRNA có thể thúc đẩy quá trình tiến triển ung thư thông qua các hoạt động sau:

• Tạo mạch máu mới quanh khối u và tăng tính thấm của mạch
• Đẩy mạnh quá trình tăng sinh, tăng trưởng khối u
• Thúc đẩy khối u di động và xâm lấn đến các vị trí khác
• Tăng khả năng tế bào ung thư kháng thuốc hoá trị
• Ức chế khối u chết theo chu trình

Mặt khác, một số ncRNA giữ vai trò như chất ức chế khối u bằng cách:

• Ức chế khối u tăng trưởng, tăng sinh, di động, xâm lấn và di căn
• Tăng độ nhạy cảm của khối u với thuốc hoá trị
• Tái cấu trúc vi môi trường khối u

MiRNA

MiRNA liên kết với vùng trình tự đặc hiệu trên một số phân tử mRNA được gọi là MRE (miRNA response element) nhằm phân giải chúng, qua đó quá trình dịch mã bị dừng lại. Một miRNA có thể giữ nhiều vai trò khác nhau tuỳ vào loại ung thư. Chẳng hạn, miRNA miR-125 có khả năng thúc đẩy ung thư và tăng biểu hiện trong tế bào ung thư đại trực tràng, ung thư cổ tử cung, ung thư thực quản, ung thư phổi, u thần kinh đệm. Tuy nhiên, phân tử này có thể ức chế khối u trong bệnh ung thư gan, ung thư biểu mô tế bào vảy cổ tử cung và ung thư hắc tố da.

Một số miRNA giữ vai trò thúc đẩy hoặc ức chế khối u bao gồm:

Loại ung thư	MiRNA thúc đẩy ung thư	MiRNA ức chế khối u
Đại trực tràng	miR-21–5p, miR-1908	miR-656–3p, miR-1254, miR-128–5p
Thực quản	miR-3656	miR-148a-3p
Biểu mô tế bào gan	miR-221–3p, miR-103a–3p	miR-124–3p, miR-148a–3p, miR-373–3p
Phổi không tế bào nhỏ	miR-20a	miR-7–5p, miR-630
Tuyến tiền liệt	miR-375, miR-153	miR-143
Vú	miR-345–3p, miR-181a–5p	miR-328–3p, miR-135
Tuỵ	miR-21a-5p	miR-217
Dạ dày	miR-769–5p	miR-3648

circRNA

NcRNA mạch vòng circ-ZNF609 là đối tượng của nhiều nghiên cứu về bệnh ung thư. Circ-ZNF609 tăng biểu hiện trong tế bào ung thư vú, cổ tử cung, dạ dày, đại trực tràng và u thần kinh đệm. Phân tử này liên kết với các miRNA nhằm ngăn cản tương tác giữa miRNA với mRNA, qua đó điều hoà biểu hiện gen sau bước phiên mã, thúc đẩy khả năng tăng sinh, xâm lấn, di động và các đặc điểm ác tính khác của khối u. Bên cạnh đó, một số circRNA có khả năng ức chế khối u như circFGD4 trong ung thư dạ dày và circLPAR1 trong ung thư đại trực tràng.

Một số circRNA có khả năng dịch mã thành protein và giữ vai trò ức chế khối u. Chẳng hạn, protein hình thành từ circFBXW7 có thể ngăn chặn quá trình tăng sinh của tế bào ung thư và giảm tốc độ của chu kỳ tế bào khối u.

Một số circRNA giữ vai trò thúc đẩy hoặc ức chế khối u bao gồm:

Loại ung thư	circRNA thúc đẩy ung thư	circRNA ức chế khối u
Đại trực tràng	CircEZH2	CircMETTL3, CircEXOC6B
Thực quản	CircBCAR3	CircFAM120B
Biểu mô tế bào gan	CircSORE	CircRPN2
U thần kinh đệm	CircCDK14	CircBTG2, CircLRFN5
Cổ tử cung	CircCCDC134, CircTICRR	Circ_0087429
Vú	CircCDYL2, CircROBO1	CircKDM4B, CircRNF10
Dạ dày	CircARID1A, CircTHBS1, CircPDIA4	CircEIF4G3, CircPFKP, CircIPO7

LncRNA

Bên cạnh các lncRNA mạch vòng, HOTAIR là một trong những lncRNA mạch thẳng tăng biểu hiện trong nhiều loại ung thư. Phân tử này tập hợp protein PRC2 và LSD1 tại gen mục tiêu nhằm kích hoạt các biển đổi di truyền biểu sinh như gắn gốc methyl lên ADN, qua đó ức chế biểu hiện gen. Bên cạnh đó, HOTAIR cũng tham gia tập hợp protein E3 ubiquitin ligase giữ vai trò phân giải protein. Người ta ghi nhận HOTAIR có biểu hiện tăng cao đối với bệnh nhân ung thư vú và là yếu tố quan trọng đối với khả năng sống, di động, xâm lấn của khối u.

Một trong những lncRNA giữ vai trò ức chế khối u trong ung thư vú là BC069792. Biểu hiện của BC069792 giảm trong tế bào ung thư và tỉ lệ nghịch với khả năng di căn đến hạch bạch huyết—tiêu chí đánh giá mức độ nghiêm trọng của bệnh.

Một số lncRNA giữ vai trò thúc đẩy hoặc ức chế khối u bao gồm:

Loại ung thư	lncRNA thúc đẩy ung thư	lncRNA ức chế khối u
Đại trực tràng	LncITGB8-AS1	LINC00978
Thực quản	LncCASC8, LncTMPO-AS1	LncTUSC8
Biểu mô tế bào gan	LncPDPK2P	LncHEPFAL
Cổ tử cung	LncSFTA1P	LncMEG3
Vú	LncROPM, LncSPINT1-AS1, LncCDC6	LncFFGF13-AS1, Lncrp11–551L14.4
Tuỵ	LINC00460	LINC00673
Dạ dày	LncSNHG11, LncEIF3J-DT, LncNKX2–1-as1	LncCRNDE, LncTPTEP1

ncRNA khác

Một số loại ncRNA khác liên quan đến hoạt động của khối u bao gồm:

• PiRNA: gắn gốc methyl lên ADN, chỉnh sửa cấu trúc chất nhiễm sắc, thúc đẩy ung thư tiến triển nhanh hơn.
• SnoRNA: gắn gốc methyl lên ADN, chuyển uridine (một trong 4 đơn vị cấu tạo nên mRNA) thành uridine giả.

Các phương pháp nghiên cứu ncRNA

Phân tích biểu hiện ncRNA

Biểu hiện bất thường của các ARN không mã hóa, đặc biệt là miRNA và lncRNA, là tính chất nổi bật của nhiều tế bào ung thư. Các phương pháp phân tích biểu hiện ncRNA có thể cung cấp nhiều thông tin quan trọng giúp xác định những biomarker liên quan đến khối u.

Microarray

Công nghệ vi mảng (microarray) có thể phân tích đồng thời biểu hiện của một lượng lớn ARN, bao gồm cả miRNA và lncRNA, dựa trên nguyên lý lai nucleic acid giữa ARN mục tiêu và các đầu dò đặc hiệu. Microarray có ưu điểm về chi phí, khả năng phân tích đồng thời số lượng lớn mẫu và phát hiện những phân tử ARN có biểu hiện thấp. Tuy nhiên, kỹ thuật này chỉ được áp dụng với những trình tự đã biết và chỉ có thể định lượng các ncRNA trong một khoảng xác định.

SAGE

Phân tích chuỗi biểu hiện gen (serial analysis of gene expression—SAGE) là kỹ thuật giải trình tự hiệu suất cao đầu tiên có thể định lượng và nhận diện trình tự phiên mã, bao gồm ncRNA. SAGE phiên mã ngược ARN thành các đoạn cDNA ngắn (9 bp) gọi là SAGE tag, nối chúng lại, nhân bản và giải trình tự. Phiên bản cải tiến SuperSAGE có thể tạo ra cDNA dài hơn (26 bp), nhờ đó tăng độ chính xác của phương pháp.

Giải trình tự ARN

Giải trình tự ARN (RNA sequencing) là một trong những kỹ thuật phân tích transcriptome (toàn bộ trình tự ARN) tiên tiến nhất. Phương pháp này có thể phát hiện những trình tự hoàn toàn mới, các biến thể ARN, cũng như đột biến trên trình tự. Mặc dù giải trình tự ARN có độ chính xác cao, kỹ thuật này đòi hỏi quá trình xử lý dữ liệu phức tạp và cần nhiều trình tự để phát hiện các ARN hiếm. Nhiều nghiên cứu đã ứng dụng giải trình tự ARN để xác định các lncRNA có vai trò trong ung thư đại trực tràng và ung thư phổi. Gần đây, người ta đã phát triển kỹ thuật giải trình tự ARN trong mỗi tế bào nhằm xác định những thay đổi về mặt di truyền giữa các tế bào cùng loại và cùng pha trong chu kỳ tế bào.

CAGE

Một số loại ncRNA, đặc biệt là lncRNA được gắn gốc methyl-7-guanosine tại đầu 5’ sau quá trình phiên mã. Thành phần này bảo vệ lncRNA không bị phân giải cũng như tham gia kiểm soát vị trí và chức năng của chúng. Đồng thời, đây là dấu hiệu nhận biết các lncRNA có cấu trúc hoàn chỉnh và đang hoạt động.

Phân tích biểu hiện gen dựa trên đầu 5’ (Cap Analysis of Gene Expression – CAGE) là kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới nhằm xác định chính xác điểm khởi đầu phiên mã của ARN. Nhờ đó, CAGE không chỉ cung cấp dữ liệu về biểu hiện ARN mà còn hỗ trợ xác định các cơ chế điều hòa biểu hiện gen tại vùng trình tự khởi động phiên mã.

Phân tích tin sinh học

Người ta phân tích dữ liệu thu nhận từ các phương pháp phân tích biểu hiện ncRNA trên bằng chương trình tin sinh học, qua đó phát hiện và chú thích các đoạn ncRNA mới; xác định những thay đổi về biểu hiện; xác nhận, tái cấu trúc ncRNA đã biết cũng như dự đoán chức năng của chúng.

Đánh giá biểu hiện của ncRNA

Sau các thử nghiệm microarray, giải trình tự hoặc dự đoán in silico giúp sàng lọc những ncRNA tiềm năng, người ta xác minh biểu hiện của mỗi ncRNA bằng một số phương pháp như:

Northern blot

Kỹ thuật này bao gồm tách các ARN bằng điện di, chuyển ARN sang màng nylon và lai với đầu dò (probe) đặc hiệu có gắn đồng vị phóng xạ, sau đó ghi nhận tín hiệu của phức hợp ARN-probe. Northern blot có độ đặc hiệu cao (hạn chế dương tính giả) nhưng có độ nhạy thấp (nguy cơ âm tính giả cao), tốn thời gian, và cần một lượng lớn ARN. Điều này gây khó khăn đối với các nghiên cứu về những ncRNA có mức biểu hiện thấp như miRNA. Tuy nhiên, một số cải tiến gần đây về đầu dò có thể giúp tăng độ nhạy và độ an toàn của phương pháp này.

RT-qPCR

PCR định lượng phiên mã ngược (reverse transcription quantitative PCR-RT-qPCR) là phương pháp tiêu chuẩn để xác nhận kết quả từ microarray. RT-qPCR bao gồm phiên mã ngược ARN thành cDNA, sau đó khuếch đại và định lượng bằng các đầu dò hoặc thuốc nhuộm huỳnh quang như SYBR Green hay TaqMan. Hiện nay có nhiều sản phẩm thương mại giúp đánh giá ncRNA dựa trên RT-qPCR. Chẳng hạn, người ta đã ứng dụng RT-qPCR nhằm đánh giá mối liên hệ giữa HOTAIR với mức độ ác tính của bệnh ung thư vú.

ISH và FISH

Lai tại chỗ (In Situ Hybridization – ISH) và lai huỳnh quang tại chỗ (Fluorescence In Situ Hybridization – FISH) cung cấp thông tin về vị trí cũng như thời điểm biểu hiện của ncRNA trong tế bào. Các phương pháp này lai đầu dò huỳnh quang hoặc hóa học với ARN mục tiêu. Nhờ đó, người ta có thể trực tiếp quan sát mẫu bằng kính hiển vi và xác định ncRNA hiện diện trong nhân, tế bào chất hay các bào quan. Hiện nay, có nhiều cải tiến về đầu dò giúp tăng độ nhạy và đặc hiệu của phương pháp này, đặc biệt khi phân tích các ncRNA hiếm.

Nghiên cứu tương tác của ncRNA

NcRNA điều hoà biểu hiện gen thông qua tương tác trực tiếp với các phân tử khác. Trong khi phần lớn miRNA gắn với mRNA để ức chế phiên mã, lncRNA tương tác với cả ARN, ADN và protein nên có thể điều hòa biểu hiện gen tại nhiều thời điểm khác nhau. Người ta đã phát triển nhiều phương pháp để phân tích những tương tác này. Trong số đó, kỹ thuật dCHIRP phân tích từng vùng cụ thể trên ncRNA, nhờ đó có thể xác định đồng thời các tương tác ARN-ARN, ARN-ADN và ARN-protein.

Ứng dụng ncRNA trong điều trị ung thư

Phân giải ncRNA

Một trong những phương pháp phân giải ncRNA là sử dụng các đoạn nucleotide có trình tự bổ sung với ncRNA mục tiêu (Antisense Oligonucleotide – ASO). Sau khi ASO liên kết với ncRNA tương ứng, chúng tập hợp enzyme RNase H nhằm phân giải ncRNA này.

Ngoài ra, ARN có thể được phân giải thông qua tương tác với phức hợp siRNA-RNase. Người ta thường ứng dụng mô hình này trong nghiên cứu vai trò của các ncRNA. Ngoài ra, một số siRNA đã được tổng hợp nhằm ức chế hoạt động của các ncRNA thúc đẩy ung thư. Chẳng hạn, siRNA ức chế HOTAIR có thể giảm tính di căn của tế bào ung thư vú hay siRNA ức chế MALAT1 giúp khôi phục độ nhạy của u nguyên bào thần kinh đệm với thuốc hoá trị temozolomide.

Chỉnh sửa ncRNA bằng CRISPR/Cas9

Nhiều nghiên cứu đã sử dụng hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR-Cas9 để gây đột biến một số lncRNA và miRNA giữ vai trò thúc đẩy ung thư nhằm ức chế chúng hoặc chèn các ncRNA ức chế khối u vào tế bào ung thư, qua đó xác định vai trò của các ncRNA. Tuy nhiên, công nghệ này vẫn còn nhiều hạn chế như nguy cơ điều chỉnh sai mục tiêu, kích thích phản ứng miễn dịch cũng như rào cản về đạo đức trong ứng dụng lâm sàng.

Thay thế ncRNA

Phương pháp này sử dụng các phân tử có trình tự giống với một số miRNA hoặc lncRNA ức chế khối u nhằm khôi phục khả năng kháng ung thư của chúng trong cơ thể. Thuốc MRX34—với cấu trúc tương tự miR-34a và khả năng ức chế khối u tăng sinh, di động, xâm lấn—là liệu pháp điều trị ung thư dựa trên miRNA đầu tiên được đưa vào thử nghiệm lâm sàng pha 1. Mặc dù MRX34 gây ra các đáp ứng miễn dịch ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khoẻ người bệnh khiến thử nghiệm phải dừng lại, dự án này đã cho thấy tiềm năng của liệu pháp điều trị ung thư dựa trên miRNA.

Thách thức và định hướng

Các liệu pháp ARN nhằm kích hoạt ncRNA ức chế khối u hoặc sử dụng siRNA/ASO giúp phân giải ncRNA thúc đẩy ung thư có nhiều hạn chế về mặt sinh học.

Những rào cản chính trong ứng dụng ncRNA bao gồm:

• Khó di chuyển qua màng tế bào
• Nguy cơ bị enzyme nội bào phân hủy
• Kích hoạt phản ứng miễn dịch
• Tác động sai mục tiêu

Hiện nay, người ta khắc phục các vấn đề trên bằng cách đóng gói ARN trong hạt nano lipid nhằm tăng khả năng khuếch tán qua màng và bảo vệ ARN tốt hơn. Mặt khác, ARN có thể được gắn với các phân tử như GalNAc nhằm hỗ trợ khả năng hấp thu vào gan.

Thuốc phân tử nhỏ hiện đang là một trong những chiến lược thay thế tiềm năng. Chúng có thể gắn vào ncRNA tại vị trí hoạt động cụ thể nhằm ngăn cản ncRNA tương tác với các mục tiêu. Mặc dù phân tử nhỏ là đối tượng phù hợp với những phương pháp phát triển thuốc tiêu chuẩn nhưng chúng có độ đặc hiệu thấp và đòi hỏi quy trình thiết kế phức tạp.

Lời kết

ARN không mã hoá, đặc biệt là miRNA và lncRNA giữ nhiều vai trò quan trọng trong quá trình hình thành và phát triển các bệnh ung thư. Hiện nay có nhiều công nghệ tiên tiến được phát triển và ứng dụng nhằm phân tích biểu hiện của ncRNA cũng như tìm hiểu chức năng, cơ chế hoạt động của chúng trong các tế bào ung thư. Những nghiên cứu này cho thấy tiềm năng phát triển liệu pháp điều trị ung thư dựa trên ncRNA. Tuy nhiên, độ bền, tính đặc hiệu, độc tính và khả năng hấp thu là những rào cản chính đối với khả năng ứng dụng thuốc dựa trên ncRNA trong lâm sàng. Các nghiên cứu cần tiếp tục làm rõ vai trò của ncRNA đối với từng loại ung thư cũng như phát triển phương pháp vận chuyển thuốc nhằm tăng hiệu quả điều trị và giảm tác dụng phụ.